このプロトコルは、NF-κ-Bルシファーゼレポーターを発現する細胞におけるNF-κ-B活性化の変化を決定するのに有用である。この技術の主な利点は、NF-kappa-B活性化の変化につながる要因または条件のハイスループットスクリーンを可能にすることです。NF-κ-Bは、多種多様な細胞プロセスの転写因子である。
NF-κ-Bの周知の機能は、様々なサイトカインおよびケモカインの発現を誘導することによって炎症反応の誘導にある。私たちの研究室は、特に、サルモネラ菌の腸炎によって誘導されるNF-κ-Bの誘導に関心を持っています。ここでは、NF-κ-Bルシファーゼレポータープラスミドと安定してトランスフェクションされるHeLa細胞株を用います。
他の細菌、あるいはウイルスまたは化学化合物も、この細胞株中でNF-κ-Bの活性化を研究するために使用することができる。他の細胞株は、その細胞株中にこのようなNF-κ-Bルシファーゼレポータープラスミドを導入することができる場合にも使用することができる。これを初めて行う人は、細胞培養や細菌の仕事に必要な無菌技術を適切に利用する問題があるかもしれません。
細胞刺激の1日前に、約75%の合流度に成長したHeLa57A細胞の増殖培地を除去する。0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルで細胞を洗浄します。別のミリリットルのトリプシンEDTAに交換し、フラスコを37°Cのインキュベーターに5分間移します。
細胞がフラスコから切り離された後、10ミリリットルの増殖培地に懸濁させる。セルサスペンション10マイクロリットルとトリパンブルーの10マイクロリットルを組み合わせ、ピペットを上下に混ぜ合わせ、セルカウンタースライドに10マイクロリットルを移します。細胞カウンターを使用して懸濁液中の細胞を数え、増殖培地を使用して、50ミリリットルの円錐管で1ミリリットル当たり5個の細胞に2.5倍の濃度に細胞を希釈する。
48ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液の250マイクロリットルを移します。均質な細胞懸濁液を確保するために、定期的にコニカルチューブをキャップしてひっくり返します。プレートを側面にそっとタップして、ウェル内で細胞が均一に分配されるようにします。
5%の二酸化炭素インキュベーターでプレートを摂氏37度に移し、細胞が一晩で付着して成長できるようにします。単一のコロニーを生成するためにLB寒天プレートにサルモネラ菌のストリーク冷凍ストック。プレートを摂氏37度に設定したインキュベーターに移し、一晩の成長を可能にします。
翌日、無菌細菌培養チューブにLBを3ミリリットル加え、適切な抗生物質を培地に添加する。滅菌接種ループを使用して、縞模様の細菌培養物から単一のコロニーを選び、ループをLB培地に触れる。接種後にチューブをキャップし、ループを捨てます。
37°Cと180 RPMに設定された振る振るインキュベーターにチューブを入れ、細菌が一晩成長できるようにします。午前中、インキュベーターから一晩細菌培養物を回収する。新鮮なLBと抗生物質の3ミリリットルを追加することにより、サブカルチャーのためのチューブを準備します。
一晩細菌培養物の30マイクロリットルを作りたての培地に移す。37°Cに設定された揺れるインキュベーターに3時間チューブを入れます。3時間のインキュベーションの後、無菌LBスープの1ミリリットルをプラスチックキュベットに移してブランクとして機能させます。
900マイクロリットルのLBを他のキュベットに移し、サンプル分析に使用します。100マイクロリットルの細菌サブカルチャーを900マイクロリットルのLBを含むキュベットに移し、ピペットを数回上下に混合します。細菌懸濁液ごとにこれを繰り返します。
分光光度計をオンにして、600ナノメートルの波長で細菌培養物の光学密度を測定します。分光光度計にブランクを入れる。方向を書き留めます。
蓋を閉じ、分光光度計の空白のボタンを押して、背景吸光度を得ます。ブランクキュベットを同じ向きのサンプルキュベットに置き換え、Read を押します。これらのサンプルの OD600 値を記録します。
希釈係数を考慮するために、値に 10 を掛けます。懸濁液をキュベットで1〜10に希釈し、吸光度を測定し、ミリリットル当たり10倍の10倍に相当する約0.1の値を与える必要があります。新しいチューブでは、希釈されたサブカルチャーの適切な量を新鮮なLBに加え、接種物として使用される1ミリリットル当たり8 CFUに10倍の懸濁液を達成する。
50マイクロリットルの細菌懸濁液を、1ミリリットル当たり約100CFUの最終的な希釈がなされるまで、450マイクロリットルの無菌PBSを含むチューブに移すことによって、接種物の連続希釈を調製する。2つの最も低い希釈液の100マイクロリットルを、1ミリリットル当たり100と1000 CFU、2つのLB寒天プレートに移し、セルスプレッダーで懸濁液を広げて単一コロニーを得る。これらのプレートを摂氏37度のインキュベーターに移し、一晩インキュベートします。
翌日、コロニーを数え、初期接種の細菌濃度を計算して、実際の接種濃度を決定します。同じ日に、各ウェルに使用される感染条件に応じてプレートの蓋にラベルを付け、各状態は三重で行われます。適切な井戸に接種物の10マイクロリットルを追加し、無感染制御井戸に無菌LBの10マイクロリットルを追加します。
感染時間を同期させるには、プレートを卓上遠心分離機に入れ、500倍Gで5分間回転し、プレートのバランスが取れなくて済みます。その後、感染した細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターに1時間移す。次のステップで使用するために、細胞培養培地のアリコートを含む15ミリリットルの円錐管を摂氏37度の水浴に入れます。
感染後1時間、細胞培養培地を含む15ミリリットルの円錐チューブを水浴から取り出し、70%エタノールで外装を拭く。培養器からバイオセーフティキャビネットに組織培養プレートを移します。ウェルから培地を吸引し、新鮮な温かい細胞培養培地の250マイクロリットルに置き換えるために無菌のヒントを使用してください。
さらに4時間、37°Cで5%の二酸化炭素インキュベーターにプレートを戻します。その後、二酸化炭素インキュベーターからプレートを取り出し、ウェルから培地を吸引する。ルシファーゼ分析のために、1X細胞のライシスバッファーの100マイクロリットルをウェルに加えます。
プレートをマイナス80°Cの冷凍庫に移し、少なくとも30分間インキュベートして効率的な細胞リシスを確保します。次に、凍結した細胞のライセートを含むプレートをベンチに置いて解凍し、メーカーの推奨に従ってルシファーゼの基質試薬を調製します。ルシファーゼ基質試薬を室温に平衡化させます。
次に、プレートリーダーをオンにして、対応するリーダープログラムを開きます。発光を測定する機械を設定します。各細胞の10マイクロリットルを不透明な96ウェルプレートのウェルに移します。
マルチチャンネルピペットを使用して、不透明板の各ウェルに50マイクロリットルのルシファーゼアッセイ試薬を加える。側面のプレートを軽くタップして井戸を混ぜ、底面が液体で覆われているようにします。プレートリーダーにプレートを置き、読み取りを開始します。
ルミネセンス値をスプレッドシートプログラムにコピーし、結果をプロットします。このプロトコルは、HeLa細胞のラインに安定的にトランスフェクトされるNF-κ-B依存性ルシファーゼレポーターを用いた転写因子NF-κ-Bの活性化に焦点を当てています。本図は、サルモネラ菌に感染したHeLA 57A細胞におけるNF-κ-B依存性ルシファーゼ活性化およびIL6遺伝子発現の代表的な実験を示す。
野生型SL1344株の感染は、RLUおよびIL6発現の両方で強力なルシファーゼシグナルを誘発し、これはsipA sopB sopE2トリプル突然変異体に感染した細胞で減少し、sipA sopB sopE2 sopE2 sopE 4倍量突然変異体で制御レベルに低下した。シリアル希釈やめっきをする際には細心の注意を払ってください。これにより、あなたの株全体で一貫した接種を持っていることを保証します。
MRNA発現のNF-κ-B活性化および下流変化に寄与する因子を同定した後、ウェスタンブロット法を用いてタンパク質発現の変化を同定することができる。このプロトコルにより、サルモネラ菌によって誘導されるNF-κ-B活性化だけでなく、NF-kappa-B活性化に関与する他の化合物およびタンパク質を評価することができました。サルモネラ菌はヒト病原体である。
これらの細菌を使用する場合は、適切なPPEを使用してください。
