著者らはこの研究を通して貴重な議論と支援をCirillo研究室のメンバーに感謝。我々は、博士ジョシュアヒルとこのプロトコルの撮影時の支援のための博士はジェームズサミュエルの研究室に感謝。この作品は、国立衛生研究所から、ビル＆メリンダゲイツ財団と助成金AI47866から助成金48523によって賄われていた。

1。気管内挿管による肺感染症<ol><li>マウスの重量を測定し、必要に応じて、マークが容易な識別のための耳で行うことができます。 </li><li>腹腔内接種でケタミン（マウス体重1gあたり100μgの）とキシラジン（マウス体重1gあたり10μg）を有するマウスを麻酔。 </li><li>完全に麻酔まで、ケージの中で場所のマウス。ペダル反射を確認するには、足のパッドを絞る。マウスは、減少または無反射反応を表示する必要があります。 </li><li>その後ろに横たわって挿管のスタンドの上にマウスを置きます。 </li><li>挿管のスタンドにゴムバンドを修正してから、マウスの上顎の下に置きます。挿管のスタンドに足と腕を固定するテープを使用してください。 </li><li>静かにピンセットを使って口から出てトゥーゲ移動。 </li><li>口のoctoscopeの内側に鏡を挿入し、喉頭の開口部が見えるようになるまで中咽頭に見える。 </li><li> catetherハブまで気管にcathetherで覆われて、事前のガイドワイヤーは、歯になります。ガイドワイヤを外します。胸の拡大を観察し、適切な挿管を確認するためにcathetherに空気を入れて。 </li><li> 1 mLの注射器を使用してcathetherを通して細菌（画像では我々が我々の研究室で構築されたコメツキムシ赤色ルシフェラーゼ（CBRLuc）を発現する菌カルメットゲラン（BCG）を使用するように、しかしいかなる発光菌株を使用することができます）溶液50μLを注入する。 </li><li>ケージにマウスを置いて、麻酔から回復する際、それを観察。 </li></ol> 2。動物の麻酔および生物発光イメージングのための準備マウスは、XGI - 8ガスAneshesiaシステムを使用してイソフルランで麻酔する。 <ol><li> XGI - 8麻酔システムを操作する前に、各チャコールフィルターのキャニスターの重量を測定し、その上に体重と日付を書き込む。重量は、初期重量の上に50グラムの場合は、新しいキャニスターと交換してください。 </li><li>気化器のイソフルランのレベルをチェックし、必要に応じて記入してください。 </li><li> XGI - 8麻酔システムの前面に排気ポンプの電源を入れ、8 LPM（minuiteリットル）に設定します。 </li><li>高圧ボンベからの酸素供給をオンにし、55 PSIGに設定します。 </li><li> XGI - 8麻酔システムの前面にトグル酸素（緑）をオンにします。 </li><li>ガス流量のレベルを設定するには、イメージングチャンバーにガス流量をオンにします。 0.25 LPMに設定してから、ガス流量をオフにしてください。 </li><li>ガス流量のレベルを設定するには、麻酔導入チャンバーにガス流量をオンにします。 1.5 LPMに設定してから、ガス流量をオフにしてください。 </li><li>気化器と2から2.5パーセントに設定してイソフルランをオンにします。イソフルランレベルが使用されている動物や体重の数に応じて調整することができます。 </li><li>誘導室にマウスを置き、蓋を閉じます。誘導室へのガスの流れをオンにします。 5室の場所をマウス - 10 minuitesは、​​彼らが完全に麻酔されるまで。 </li><li>撮像中にマウスの目を保護し、麻酔マニホールドのノーズコーンのいずれかでの撮像室内でマウスを配置する目に光軟膏を適用します。隣接する動物の被験者に光の反射を防ぐために、マウスとの間の光バッフルを使用してください。 </li><li>腹腔内接種によるルシフェリン（150μgの/体重1g）注入。 </li></ol> 3。生物発光イメージング<ol><li>リビングのイメージングソフトウェアを起動します。 </li><li>システムが初期化されていない場合、IVISイメージングシステムを初期化する。 </li><li> IVIS取得コントロールパネルでのシーケンスのセットアップをクリックして、イメージングのためのパラメータを設定します。 イメージングモードでの発光と写真を選択してください。 DLIT 3次元再構成を実施するためのオプションを希望する場合は、イメージシーケンスの一部として、写真の発光性と構造的な光の画像を選択します。 0.5秒から10分まで露光時間を設定します。 サンプルの予想される明るさに基づいて、ビニングとF /停止を設定します。 光の特定波長を取得することを計画していない限り、開こうとするフィルタブロックおよび排出にフィルタ励起を設定します。 DLIT 3D憲法の場合には、ソースの正確な局在を可能にするために波長の異なる複数の発光フィルターを設定します。 マウスまたは動物の地域イメージを作成する数に応じてDにからFOVを設定します。 4月5日マウスのために1マウス、2-3マウスのためのC、およびDのAとBを選択します。 </li><li>シーケンスの設定を追加するには、買収の[コントロールパネル]の[イメージウィザードで[追加]をクリックします。 </li><li>取得をクリックして、撮像シーケンスを開始します。 DLIT 3D構造の場合には、蛍光画像は、異なる波長の複数の発光フィルター用に取得されます。写真と構造化された光の画像も取得されます。 </li><li>買収時に画像と画像のレベルのパネルを編集するには、表示されます。後で倍で画像の簡単なトラッキングを保証して画像を保存する編集画像内の各実験のため、可能な限り詳細な情報を入力します。 </li><li> IVISイメージングチャンバーからマウスをReRemoveとそのケージに戻す。からの回復を観察マウスを確保するために感覚が大幅に手順により影響されなかった。彼らは完全に麻酔（通常1〜2分）から回復するまでの動物は、常に監視する必要があります。 </li></ol>肺の中の細菌の定量4。ex vivoでのイメージングおよびCFU分析<ol><li>安楽死の直前に、イメージングのためのと同様の方法でルシフェリン腹腔内でマウスを注入する。 </li><li>ルシフェリンの投与後に100 mg / kgをpentobarbitol 5分の腹腔内注射によってマウスを安楽死させる。 </li><li>滅菌ピンセットやハサミを用いて滅菌ペトリ-皿のマウスと場所から肺を外植片。 </li><li>場所シャーレイメージングチャンバーの外植臓器を含むと全体のマウスの場合と同じ方法で生物発光画像を取得する。 </li><li>イメージング後、滅菌ピンセットを用いてペトリ皿から植臓器を削除し、1mLのPBS中でホモジナイズする。 </li><li>適切な選択培地で希釈し、プレートの組織を作る。ホモジナイズした組織は、それが必要でなければ、再メッキのために-80℃で保存することができます。また、ホモジナイズした組織は、定量PCRによって細菌数を定量化するRNAまたはDNAの抽出に使用することができます。 </li></ol> 5。発光イメージングの解析<ol><li> &quot;リビングイメージングソフトウェア&quot;を起動し、画像ファイルを参照します。 </li><li>画像を調整する&quot;ツールパレット&quot;を使用してください。個別のカラースケールの補正/フィルタ処理の設定と最小/最大を変更するために調整し、画像をクリックする。 </li><li>光強度の定量化のためのプルダウンリストで、ROIツールを使用してください。 ROIの形状、数およびサイズ​​を選択してください。画像上に関心領域にROIのフレームをドラッグします。すべてのROIが同じサイズと形状であることを確認してください。 ROIの測定をクリックし、保存、コピーおよび/または定量的なデータをエクスポートする。 </li><li> DLIT 3D再構成の場合には、構造化された光の像を含む画像シーケンスをロードする。ツールプラットの表面形状をクリックします。プルダウンリストで、表面形状を生成するためのタブを再構築]をクリックします。表面の混乱は、ウィンドウに表示されます。 </li><li>ツールプラットのDLIT 3D再構築]を選択します。プルダウンリストでは、組織特性やソースのスペクトルを設定するには、[プロパティ]タブをクリックします。筋肉は、ほとんどの状況下で推奨されます。プルダウンリストでは、分析のための波長を選択するために分析タブをクリックします。パラメータタブをクリックし、デフォルトの値を確認するか、必要に応じてDLITパラメータを調整する。 3D解析を開始するためにタブを再構築]をクリックします。 </li><li> 3次元再構成が終了すると、3Dビューでは、3D再構成の結果が表示されます。光子密度、ボクセルとDLITアルゴリズムパラメータの解析データを表示するには、結果のタブをクリックします。 </li><li>保存して/または数値とデータファイルに3D再分析の結果をエクスポートする。 </li></ol> 6。代表的な結果： 非感染マウスのコントロールと一緒に生物発光細菌に感染したマウスの生物発光画像を図1に示されています。生物発光細菌に感染したマウスの肺は、肺（図1）から有意な信号を生成する。発光強度は、ROI内の全光束（関心のある領域）（図2）として定量化されます。光強度の定量的データは、信号が生物発光細菌から生産されており、ネガティブコントロールと比較することができることを確認するために、肺から得られた細菌のコロニー形成単位（CFU）のために正規化されています。信号の位置と強度はさらに、マウスの表面11の断層撮影法に基づいて、発光源のDLIT 3次元復元によって分析することができます。これらの分析は、生成される生物発光シグナルの定量化とローカライズを可能にする。感染マウスの発光源の3D再構成の結果は、光がマウスの肺（図3）から生産されていることを示しています。その発光確認の結果、マウスの肺のex vivoでのイメージは、むしろいくつかの他の密接に並置された組織または器官（図2C）よりも、肺から放出される。 <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 CBRlucでタグ付けされた生物発光細菌による肺感染マウスの発光イメージング。非感染コントロールマウスは左側にであり、2つの感染マウスが右側にあります。マウスは、気管内経路を経由してCBRluc（N = 2）を発現する細菌に感染していた。背、腹、左側と右側：ルシフェリンの注射後10分は、発光の画像は4ポジションで10分間を取得した。 <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 CBRlucを表現する細菌に感染したマウスからの定量的な光強度（A、B）ROI分析と背側と腹側の位置におけるROIからの光の定量化全光束の発光イメージを、それぞれ。非感染マウスは左側に、もう2つに感染したマウスは右側にあります。発光画像は、肺oから取得したFマウス感染していないとCBRlux（N = 2）に感染している。肺の周りの光強度は、ROIの分析により定量した。 C）（肺の下部にある二組）感染していない（上）と感染マウスからの肺の ex vivo での画像が。その後、買収された安楽死と画像の前にルシフェリンを5 miniutsを注入した。定量値は、CFUに正規化されます。 <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。肺感染マウスからの生物発光源の3次元再構成（複数可）。マウスは、気管内注入によるCBRlucを表現する細菌を感染させた。イメージシーケンスは540〜700 nmまでのシリアル波長の異なる発光フィルターを用いて取得された。イメージシーケンスは、構造化されたIMAGが含まれている動物の被験体における発光源のための3D再構成のために使用されていました。左と右、背面、前面：A）マウスのための断層撮影は、異なる位置に表示されます。光源は、再建によって決定される肺内に配置されているボクセル（3Dマウス内の赤いボックス）として表示されます。 B）実測データとシミュレーションデータのフォトンdensiyマップが。測定値とシミュレートされた光子の密度曲線を比較すると、再建の質の情報を提供しています。同様の測定値とシミュレートされた光子の密度で良好な品質の再構成結果。

<ol>
	<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence.">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors.">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li><li>Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli.">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li><li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions:+a+review.">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li><li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li></ol>

動物研究は、テキサスA＆M大学の動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

これらのプロトコルは、通常、高品質の画像につながる次のようですが、それは、イメージングの研究から、正確で一貫性のあるデータを得るためにいくつかの主要な問題を考慮することが重要です。発光画像は、信号が背景の上にあるとカメラが飽和されていないことを保証するために600〜60,000カウントを持っていることを取得しておく必要があります。得られた信号は600m以内であれば露...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

イメージングは​​、生物学的プロセスを監視するために使用することができる貴重な技術です。特に、癌細胞、幹細胞、特異的な免疫細胞の種類、ウイルス性病原体、寄生虫や細菌の存在は1-2動物の生活の中でリアルタイムで追跡することができる。病原体の研究への生物発光イメージングのアプリケーションは、図3-4動物モデルにおける感染症の分析のための従来の戦略に比べて利点があります。感染症は病原体の位置と量を決定するために安楽死を必要とせず、時間をかけて個々の動物の中で可視化することができる。光イメージングは​​、包括的なすべての組織や器官の検査ではなく、以前に感染していることが知られているサイトのサンプリングが可能。さらに、特定の組織への接種の精度は、事前に直​​接失敗した実験全体を通して接種前方に動物を運ぶために決定することができます。イメージングは​​、各動物を個々に続くことを可能にするので、動物との間のばらつきは、してコントロールすることができます。イメージングは、非常にために3〜4病原体の負荷を決定するために組織をサンプリングすることなく、多数の時点からデータを取得する機能が必要な動物数を削減する可能性があります。 このプロトコルは、ルシフェラーゼを発現する細菌の組換え株のために生物発光イメージングを使用して、生きた動物での感染を可視化する方法を説明します。コメツキ ​​ムシ（CBRLuc）とホタルルシフェラーゼ（FFluc）は、基板5月6日としてルシフェリンを利用する。 CBRlucとFFluc両方によって生成される光は、生きている動物モデル7-9の光学的イメージングのためのこれらのルシフェラーゼの優れた記者を作り、500〜700 nmまでの広い波長を持っています。 600 nmのより大きい光の波長はヘモグロビンによる吸収を避けるためと、そのため、効率的に哺乳動物の組織を通過する必要があるため、これは主にです。ルシフェラーゼは、遺伝子的に光信号10を生成するバクテリアに導入する。マウスは、リアルタイムで感染症のモニタリングを可能にするために気管内生物発光細菌を接種した肺です。ルシフェリンの注入後、画像がIVISイメージングシステムを用いて取得されます。撮像中に、マウスはXGI - 8ガスAnethesiaシステムを使用してイソフルランで麻酔する。画像をローカライズすると、それぞれ、細菌感染の部位（複数可）と数字を表す信号源を、定量化するために分析することができます。イメージング後、CFU決定は、細菌の存在を確認するためにホモジナイズした組織で行われている。細菌のいくつかの投与量は、発光して細菌数を関連付けるために使用されます。イメージングは​​、抗菌性化合物およびワクチンの有効性の病因と評価の研究に適用することができます。

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

生きている動物における細菌感染症の生物発光イメージングのための方法が説明されています。病原体は、生きた動物における感染症の光学全身イメージングを可能にルシフェラーゼを発現するように変更されます。動物モデルは、ルシフェラーゼを発現する病原体に感染し、病気の結果として得られるコースは、生物発光イメージングによってリアルタイムに可視化することができます。

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K ビュー.  Texas A&M Health Science Center. 生きている動物における細菌感染症の生物発光イメージングのための方法が説明されています。病原体は、生きた動物における感染症の光学全身イメージングを可能にルシフェラーゼを発現するように変更されます。動物モデルは、ルシフェラーゼを発現する病原体に感染し、病気の結果として得られるコースは、生物発光イメージングによってリアル?...

ビデオ: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

免疫・感染学

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Methods Article

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた