この方法は、神経前駆細胞のダイナミクスと脊椎動物の脳の発達の根幹となる子孫に関する基本的な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、開発の多くの時間にわたって生きている脳内のクローン関連細胞の複数のクラスターを直接視覚化する能力です。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の他の発達系におけるクローンおよび前駆体ダイナミクスの研究にも適用することができる。
この方法を用いた可視化は、神経発達中に起こる基本的なプロセスを直接観察するのに特に有用である。マイクロ注射を行う前の午後に、セックス分離交配タンクに野生型成虫ゼブラフィッシュを設置する。翌朝、原稿の指示に従ってDNA溶液を調製し、受精後45分以内にこの溶液の約4.2ナノリットルを1つの細胞ゼブラフィッシュ胚に注入する。
注入された胚をE 3培地と28°Cのインキュベーターで24時間維持し、グループから死んだ胚と変形した胚を呼び出す。50ミリリットルのチューブに最大20個の健康な胚を移し、10ミリリットルのE 3で満たし、各チューブの上にキャップを置きます。50ミリリットルのチューブを37°Cのウォーターバスに80〜90分間直立させ、お風呂の水位がチューブ内のE 3よりも高いことを確認します。
水浴からチューブラックを取り外し、摂氏28度のインキュベーターに入れます。E 3が冷却し、胚が温度に再水応するのに最大1時間かかります。その後、0.2ミリモルPTUとE 3摂氏28度のインキュベーターで暖かく保たれたペトリ料理にそれらを転送します。
ヒートショックの2~4時間後に、標準的な蛍光解剖顕微鏡で、ビエンボン組換えの成功を示すCFPまたはYFPの発現について胚を調べる。全体に堅牢なFP発現を持つ胚を選択し、PTUと別の皿に転送します。受精後1、2、または3日を画像化します。
蛍光顕微鏡下で薄暗く見える発現は、実際には共焦点タイムラプスイメージングでよく視覚化され得る。実験の日に先立って、イメージングチャンバーと胚操作ツールを準備します。イメージングチャンバーを準備するには、プラスチックリングを60ミリメートルのペトリ皿の中央に慎重にスーパーグルーします。
4インチの木製綿棒の端にナイロン釣り糸の小さな長さを接着することによってマニピュレータを構築します。必要に応じて、取り付け前に解剖顕微鏡の下で胚をデコール化する。胚を取り付けるには、魚を画像チャンバーのプラスチックリングの中心に移し、細かいチップトランスファーピペットでできるだけ多くの余分なE3を取り除きます。
きれいな移管ピペットを使用して、1%の低溶融アガロースとE 3で魚を覆い、プラスチックリング全体をアガロースの層で満たします。その後、気泡を導入することなく、ピペット先端にゆっくりと胚を引き上げ、アガロースに戻します。胚マニピュレータを使用して、魚とアガロースを硬化させる前に素早く向けます。
直立顕微鏡でイメージングする場合は、胚をアガロースの上面にできるだけ近くに置き、尾をまっすぐにしてイメージングチャンバーの底に平行であることを確認します。アガロースが硬化するのを待ってから、イメージングチャンバーをE 3で満たし、イメージングの過程で蒸発を考慮して可能な限り追加します。共焦点顕微鏡の上に魚とE 3とイメージングチャンバーを置きます。
次に、高い数値開口と長い作業距離で目的を選択します。セルの適切な緻密で明るいラベリングを持つ領域を見つけ、取得パラメータを設定します。これはZenソフトウェアを使用した例ですが、設定は利用可能な顕微鏡やレーザーラインによって異なります。
各 FP チャネルを順番にイメージ化する 3 つのトラックを準備します。アルゴンレーザーを使用してCFPを458ナノメートル、YFPを514ナノメートルで励起し、DPSS 561ナノメートルレーザーを使用してdTomatoを励起します。適切な波長で3つのミッションを収集します。
画像に Z スタック範囲を選択し、10 ~ 30 分の時間間隔を選択して、ミトティック イベントとアポトーシス イベントを追跡します。最後に、イメージングセッションの長さを選択し、実験を実行します。イメージングが完了したら、Zenまたはフィジーと互換性のある別のフォーマットを使用している場合は、生データをCZI形式で保存し、バイオフォーマットの輸入者を使用してフィジーに画像をインポートします。
インビボ多色タイムラプスイメージングは、開発中のゼブラフィッシュ後脳の増殖性心室領域における細胞のBrainbow色分けクローンを示すために使用された。特定の放射状繊維に沿って配置されたBrainbowラベル細胞は同じ色を共有した。これは、相対的なRGBチャネルの重みとして定量化することができます。
これは、これらのラジオグループが分裂細胞のクローンであり、類似した色を使用してクローン的に関連していると識別できることを示唆している。定量的な色分析は、娘細胞が母親の細胞と同じ色を表すことを示した。しかし、その隣接する細胞の無線クラスターは互いに区別することができます。
関連細胞の多数のクローンは、生体内での時間にわたって同時に追跡することができ、多重系統分析および比較を可能にする。2時にクローンにおける色発現を定量化し、受精後3日で再びBrainbow発現が2~3日で比較的一定であることを示した。タイムラプスイメージングは、受精後1〜2日の間に核間移動と細胞分裂を受けている多数の細胞を明らかにし、細胞周期を研究することを可能にした。
ゼブラフィッシュの以前の測定値に匹敵する8.4時間の平均細胞周期を計算した。さらに、このイメージング技術は、膜のブレンディングや細胞断片化などのアポトーシスに関連するステレオタイプ形態変化を受けている個々の細胞を観察するために使用した。この方法は生体内で行われるため、ゼブラフィッシュを撮像チャンバーから救出し、後の時点でイメージングや他の実験のために維持することができます。
この技術を用い、神経発達中のクローン関連細胞の役割に関する新たな疑問を探究することができます。
