שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בסיסיות על הדינמיקה של תאי אב עצביים וצאצאיהם אשר ביסוד התפתחות המוח החולייתני. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לדמיין ישירות אשכולות מרובים של תאים הקשורים clonally בתוך המוח החי במשך שעות רבות של התפתחות. הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על לימוד דינמיקה שיבוט אב במערכות מתפתחות אחרות של העובר זברה.
הדמיה בשיטה זו שימושית במיוחד להתבוננות ישירה בתהליכים בסיסיים המתרחשים במהלך ההתפתחות העצבית. אחר הצהריים לפני ביצוע זריקות מיקרו, להגדיר סוג פראי דגי זברה בוגרים במיכלי הזדווגות מופרדים מין. בבוקר שלמחרת להכין את פתרון ה-DNA על פי הוראות כתב יד ולהזריק כ 4.2 ננו ליטר של פתרון זה לתוך תא אחד עוברי זברה בתוך 45 דקות של הפריה.
לשמור על העוברים מוזרק E שלוש בינוני חממה 28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ולאחר מכן להתקשר לעוברים מתים מעוותים מהקבוצה. מעבירים עד 20 עוברים בריאים לצינור של 50 מיליליטר, ממלאים אותו ב-10 מיליליטר של E 3 ומ מניחים כובע על כל צינור. מניחים מתלה עם צינורות 50 מיליליטר זקוף באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 80 עד 90 דקות, לוודא כי מפלס המים באמבטיה הוא גבוה יותר E שלוש בצינור.
מוציאים את מתלה הצינור מהאמבטיה ומ מניחים אותו באינקובטור של 28 מעלות צלזיוס. אפשר עד שעה אחת עבור E שלוש להתקרר ואת העוברים כדי להסתגל מחדש לטמפרטורה. לאחר מכן להעביר אותם מנות פטרי עם 0.2 מילימולאר PTU ו E שלוש התחמם בחממה 28 מעלות צלזיוס.
שעתיים עד ארבע שעות לאחר הלם החום, בדקו את העוברים תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי סטנדרטי לביטוי של CFP או YFP המציין קומבינציה מוצלחת של Brainbow. בחר עוברים עם ביטוי FP חזק לאורך כל והעבר אותם לצלחת נפרדת עם PTU. תדמיין אותם יום, יומיים או שלושה לאחר ההפריה.
ביטוי המופיע עמום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עשוי למעשה להיות חזותי היטב בהדמיית זמן לשגות confocal. לפני יום הניסוי, הכינו את תא ההדמיה ואת כלי המניפולציה של העובר. כדי להכין את תא ההדמיה, בזהירות דבק טבעת פלסטיק למרכז צלחת פטרי 60 מילימטר.
לבנות את המניפולטור על ידי סופר דבק אורך קטן של קו דיג ניילון עד הסוף של מקל ספוגית עץ ארבעה אינץ '. במידת הצורך, dechorionate העוברים תחת מיקרוסקופ ניתוח לפני ההרכבה. כדי לעלות על העוברים, להעביר את הדג למרכז טבעת הפלסטיק בתא ההדמיה ולהסיר כמה שיותר E שלוש עודף ככל האפשר עם פיפטה העברה הטה בסדר.
השתמש פיפטה העברה נקייה כדי לכסות את הדג עם אגרוז להמיס אחוז אחד נמוך E שלוש, מילוי טבעת הפלסטיק כולו עם שכבה של אגרוז. ואז בעדינות למשוך את העובר לתוך קצה פיפטה ובחזרה לתוך agarose מבלי להציג את כל בועות אוויר. השתמש מניפולטור עובר לכוון במהירות את הדג ואת agarose לפני שהוא מתקשה.
אם הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, למקם את העובר קרוב ככל האפשר לפני השטח העליונים של agarose, לוודא שהם מקבילים לתחתית תא ההדמיה עם הזנב שלהם ישר. המתן עד שהתעורר יתקשה, ואז מלא את תא ההדמיה ב- E 3, והוסיף כמה שיותר כדי להסביר את האידוי במהלך ההדמיה. מניחים את תא ההדמיה עם הדגים ו-E 3 במיקרוסקופ הקונפוקל.
לאחר מכן בחר את המטרה עם צמצם מספרי גבוה ובמרחק עבודה ארוך. מצא אזור עם תיוג צפוף ובהו כראוי של תאים והגדר את פרמטרי הרכישה. זוהי דוגמה באמצעות תוכנת Zen, אך ההגדרות ישתנו בהתאם לקווי מיקרוסקופ ולייזר הזמינים.
הכינו שלוש רצועות לתמונה של כל ערוץ FP ברצף. השתמש בלייזר ארגון כדי לרגש CFP ב 458 ננומטר ו YFP ב 514 ננומטר, ולהשתמש לייזר ננומטר DPSS 561 כדי לרגש dTomato. לאסוף את המשימות לשלושה באורך הגל המתאים.
בחר את טווח המחסנית Z לתמונה ומרווח זמן שבין 10 ל- 30 דקות כדי לעקוב אחר אירועים מיטוטיים ואפטוטיים. לבסוף, בחר את אורך הפעלת ההדמיה והפעל את הניסוי. לאחר השלמת ההדמיה, שמור את הנתונים הגולמיים בתבנית CZI אם אתה משתמש בזן או בתבנית אחרת התואמת לפיג'י, ולאחר מכן יבא את התמונות לפיג'י באמצעות יבואן פורמטים ביולוגיים.
ב vivo multicolor זמן לשגות הדמיה שימש כדי להראות שיבוטים מקודד צבע Brainbow של תאים באזור חדרית שגשוג של hindbrabrain זברה המתפתח. תאים המסווים ב-Brainbow המסודרים לאורך סיבים רדיאליים מסוימים חולקים את אותו צבע. אשר ניתן לכמת כמו משקולות ערוץ RGB היחסי.
הדבר מצביע על כך שקבוצות רדיו אלה היו שיבוטים של תאים מפרידים, ושצבעם הדומה יכול לשמש לזיהוים כקטנוניים. ניתוח צבע כמותי הראה שתאי בת מבטאים את אותו צבע כמו התא של אמם. אבל אשכולות הרדיו השכנים של תאים יכולים להיות נבדלים זה מזה.
שיבוטים רבים של תאים קשורים ניתן לעקוב בו זמנית על פני שעות vivo, המאפשר ניתוח שושלת מולטיפלקס והשוואה. כימות של ביטוי צבע ב שיבוטים ביומיים ואז שוב בשלושה ימים לאחר ההפריה הראה כי ביטוי Brainbow נשאר קבוע יחסית מיומיים עד שלושה ימים. הדמיית זמן לשגות חשפה תאים רבים שעברו הגירה גרעינית interkinetic וחלוקת תאים מיום אחד עד יומיים לאחר ההפריה, מה שאפשר ללמוד את מחזור התא.
מחזור תאים ממוצע של 8.4 שעות חושב אשר דומה למדידות קודמות של דגי זברה. יתר על כן, טכניקת הדמיה זו שימשה להתבוננות בתאים בודדים העוברים את השינויים המורפולוגיים הסטריאוטיפים הקשורים לאפופטוזיס, כגון פעפוט קרום ופיצול תאים. מכיוון ששיטה זו מבוצעת ב-vivo, ניתן להציל דגי זברה מתא ההדמיה ומתוחזקים לצורך הדמיה או ניסויים אחרים בנקודות זמן מאוחרות יותר.
השימוש בטכניקה זו מאפשר לנו לחקור שאלות חדשות על התפקידים של תאים הקשורים clonally במהלך התפתחות עצבית.
