Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a dinâmica das células progenitoras neurais e sua prole que estão por trás do desenvolvimento cerebral vertebrado. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de visualizar diretamente vários aglomerados de células clonalmente relacionadas dentro do cérebro vivo ao longo de muitas horas de desenvolvimento. O protocolo também pode ser aplicado ao estudo da dinâmica clonal e progenitora em outros sistemas de desenvolvimento do embrião de zebrafish.
A visualização usando este método é particularmente útil para observar diretamente processos fundamentais que ocorrem durante o desenvolvimento neural. Na tarde anterior à realização de microinjeções, configure zebrafish adultos selvagens em tanques de acasalamento segregados por sexo. Na manhã seguinte, prepare a solução de DNA de acordo com as instruções do manuscrito e injete aproximadamente 4,2 nano litros desta solução em uma célula de embriões de zebrafish dentro de 45 minutos após a fertilização.
Mantenha os embriões injetados em E três médios e uma incubadora de 28 graus Celsius por 24 horas, em seguida, chame os embriões mortos e deformados do grupo. Transfira até 20 embriões saudáveis em um tubo de 50 mililitros, encha-o com 10 mililitros de E3 e coloque uma tampa em cima de cada tubo. Coloque um rack com os tubos de 50 mililitros eretos em um banho de água de 37 graus Celsius por 80 a 90 minutos, certificando-se de que o nível de água no banho é maior do que o E três no tubo.
Retire o rack do tubo do banho de água e coloque-o na incubadora de 28 graus Celsius. Deixe até uma hora para o E3 esfriar e os embriões se reaclimatam à temperatura. Em seguida, transfira-os para placas de Petri com 0,2 milimôlar PTU e E três mantidos aquecidos na incubadora de 28 graus Celsius.
De duas a quatro horas após o choque térmico, examine os embriões sob um microscópio de dissecção de fluorescência padrão para expressão de CFP ou YFP, o que indica uma recombinação cerebral bem sucedida. Selecione embriões com uma expressão FP robusta por toda parte e transfira-os para um prato separado com PTU. Imagem-los um, dois ou três dias após a fertilização.
A expressão que aparece fraca sob um microscópio de fluorescência pode realmente ser bem visualizada em imagens de lapso de tempo confocal. Antes do dia do experimento, prepare a câmara de imagem e a ferramenta de manipulação de embriões. Para preparar a câmara de imagem, supercole cuidadosamente um anel de plástico no centro de uma placa de Petri de 60 milímetros.
Construa o manipulador super colando um pequeno comprimento de linha de pesca de nylon até o final de uma vara de cotonete de madeira de quatro polegadas. Se necessário, descorionato os embriões sob um microscópio de dissecção antes da montagem. Para montar os embriões, transfira o peixe para o centro do anel plástico na câmara de imagem e remova o máximo de excesso E três possível com uma pipeta de transferência fina.
Use uma pipeta de transferência limpa para cobrir o peixe com uma por cento de baixa agarose de derretimento e E três, enchendo todo o anel de plástico com uma camada de agarose. Em seguida, puxe suavemente o embrião para cima na ponta da pipeta e de volta para a agarose sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Use um manipulador de embriões para orientar rapidamente o peixe e a agarose antes que endureça.
Se for possível a imagem com um microscópio vertical, posicione o embrião o mais próximo possível da superfície superior da agarose, certificando-se de que eles estejam paralelos à parte inferior da câmara de imagem com a cauda reta. Aguarde que a agarose endureça, em seguida, encha a câmara de imagem com E três, adicionando o máximo possível para explicar a evaporação ao longo da imagem. Coloque a câmara de imagem com o peixe e e três no microscópio confocal.
Em seguida, selecione o objetivo com uma alta abertura numérica e uma longa distância de trabalho. Encontre uma região com rotulagem adequadamente densa e brilhante das células e configure os parâmetros de aquisição. Este é um exemplo usando o software Zen, mas as configurações variam dependendo das linhas de microscópio e laser disponíveis.
Prepare três faixas para imagem de cada canal FP sequencialmente. Use um laser de argônio para excitar CFP a 458 nanômetros e YFP a 514 nanômetros, e use um laser DPSS 561 nanômetro para excitar o dTomato. Colete as missões para os três nos comprimentos de onda apropriados.
Selecione a faixa de pilha Z para imagem e um intervalo de tempo entre 10 e 30 minutos para acompanhar eventos mitóticos e apoptóticos. Finalmente, selecione o comprimento da sessão de imagem e execute o experimento. Depois que a imagem estiver concluída, salve os dados brutos no formato CZI se usar Zen ou outro formato compatível com Fiji, em seguida, importe as imagens para Fiji usando o importador de formatos biológicos.
Imagens de lapso de tempo multicolor in vivo foram usadas para mostrar clones codificados por cores brainbow de células na zona ventricular proliferativa do cérebro traseiro de zebrafish em desenvolvimento. Células rotuladas por brainbow dispostas ao longo de uma fibra radial particular compartilhavam a mesma cor. Que pode ser quantificado como os pesos relativos do canal RGB.
Isso sugere que esses grupos de rádio eram clones de células divisórias e que sua cor semelhante poderia ser usada para identificá-las como sendo relacionadas clonalmente. Uma análise quantitativa de cores mostrou que as células filhas expressam a mesma cor que a célula da mãe. Mas esses aglomerados de rádio vizinhos de células podem ser distinguidos uns dos outros.
Numerosos clones de células relacionadas podem ser seguidos simultaneamente ao longo de horas in vivo, permitindo uma análise e comparação de linhagem multiplex. A quantificação da expressão de cor em clones aos dois e, em seguida, novamente em três dias após a fertilização mostrou que a expressão brainbow permaneceu relativamente constante de dois a três dias. Imagens de lapso de tempo revelaram inúmeras células submetidas à migração nuclear intercinética e divisão celular de um a dois dias após a fertilização, possibilitando estudar o ciclo celular.
Calculou-se um ciclo celular médio de 8,4 horas, o que é comparável às medições anteriores em zebrafish. Além disso, essa técnica de imagem foi utilizada para observar células individuais submetidas às alterações morfológicas estereotipadas associadas à apoptose, como a membrana e a fragmentação celular. Como esse método é realizado in vivo, o zebrafish pode ser resgatado da câmara de imagem e mantido para imagens ou outros experimentos em momentos posteriores.
O uso dessa técnica nos permite explorar novas questões sobre os papéis das células clonalmente relacionadas durante o desenvolvimento neural.
