この方法は、患者からの末梢血を用いてPD-1-ブロッキング抗体結合細胞を決定するため、抗腫瘍効果および免疫関連有害事象を担う特異的サブセットを同定することができる。この方法は、血液サンプルの少量を必要とし、分析プロセスはかなり簡単かつ迅速です。それはちょうどフローサイトメトリーマシンを必要とします。
まず、全血サンプルをEDTAを含む採血管に採取する。PBSで2%のウシ胎児血清の1ミリリットルで各5ミリリットル丸いポリスチレンフローサイトメトリーチューブを扱います。10秒間渦。
その後、全血サンプルの20マイクロリットルを治療した5ミリリットルの丸底管に移す。PBSに2%FBSの20マイクロリットルとヒト特異的FC受容体遮断試薬の10マイクロリットルを加えます。よく混ぜて室温で15分間インキュベートします。
次に、500マイクロリットルの赤血球のリシスバッファーを加えます。よく混ぜて室温で10分間インキュベートします。PBSに2%FBSの4ミリリットルを加え、400倍gの細胞を摂氏4度で5分間スピンダウンします。
吸引によって上清を取り除く。洗浄と吸引のプロセスを繰り返します。PBSで2%FBSの100マイクロリットルで細胞を再懸濁し、それぞれ50マイクロリットルの2つのチューブに分割します。
表面マーカー抗体を追加します。よく混ぜて、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。PBS でサンプルを 2 回 PBS で洗浄します。
PBSで2%FBSの200マイクロリットルで細胞を再懸濁します。フローサイトメーターにチューブを挿入し、推奨されるプロトコルに従って細胞を取得します。リンパ球ゲートとして10,000のイベントを記録し、分析のためにFCSファイルとしてフローデータをエクスポートします。
解析ソフトウェアでファイルを開き、アイソタイプコントロールのファイルをクリックして、前方散乱線と側散乱プロットおよびゲートリンパ球上の細胞を視覚化します。FSCH 対 FSCW および SSCH 対 SSCW を使用して単一セルを選択し、CD3 対 CD8 または CD3 対 CD4 プロットで表示します。CD8 T細胞とCD4 T細胞をそれぞれゲートします。
ゲートセルを選択し、PD-1とヒトIgG4プロットに表示します。そして、アイソタイプコントロールに基づいて、Q3を選択してPD-1ブロック抗体結合CD8およびCD4 T細胞を同定します。本研究では、測定戦略およびフローサイトメトリー分析により、患者末梢血の滴から得られたT細胞に結合するPD-1遮断抗体を検出した。
PD-1対ヒトIgG4プロットは、T細胞上のPD-1遮断抗体の結合状態を示す。オレンジ色のドットと黒色のドットは、それぞれ抗IgG4抗体とアイソタイプコントロール染色を示します。PD-1遮断抗体を投与する前に、ヒトIgG4陽性CD8またはCD4 T細胞は存在しなかったし、PD-1の発現はPD-1検出抗体によって確認された。
ニボルマブまたはペンブロリズマブ投与後、IgG4は抗IgG4抗体によってT細胞上で検出され、一方PD-1検出抗体EH12.1はT細胞上のPD-1を認識しない。赤、青、緑のゲートは、完全な結合、部分的な結合および結合の喪失をそれぞれ示します。ニボルマブおよびペンブロリズマブを中止した患者の後、CD8 T細胞に結合するPD-1遮断抗体の状態が低下した。
部分的な結合があり、最終的にバインディングが完全に失われました。RBCのライシスと血液サンプルを混ぜるようにしてください。また、この方法では、表面マーカー染色前にRBCライシスを混合することが重要なステップである。
研究者が高度なフローサイトメトリーマシンにアクセスできる場合、PD-1ブロッキング抗体結合T細胞は、PD-1ブロッキング抗体によって引き起こされる有害事象を担うT細胞型のフェノタイプのプロファイリングに適用することができるこの戦略に関連するより多くのマーカーで評価することができる。この戦略の有用性を評価するには、開発された有害事象を有する患者からのサンプリングが重要である。
