この研究の範囲は、生理学的条件下での血小板機能を評価することです。具体的には、マイクロ流体デバイスや生体表面を用いて血小板の機能を研究しています。そして、このアプローチを用いて、血小板機能障害や止血蘇生法に関する疑問に答えることができました。これは、輸血医療への応用です。
現在の血小板機能アッセイでは、選択した特定のアゴニストに応答して血小板が凝集する能力を試験することがよくあります。検出方法には、光透過率または電気インピーダンスが含まれる場合があり、これらのアッセイはプロセスサンプルを利用する場合があり、停滞してテストされます。このマイクロ流体アプローチを使用して血小板機能をテストすることにより、流体力学を組み込んで生理学的な関連性を追加します。
流体力学は、止血中の血小板機能に関与する生物学的メカニズムにおいて重要な役割を果たします。出血している患者では、血小板の機能と、より良い結果を得るためにその機能を強化する可能性のある治療的介入について特に懸念しています。この血小板機能検査アプローチを使用すると、実験におけるさまざまな血小板集団の寄与を追跡し、外傷やその他の出血状態の治療オプションを評価する方法を切り開くことができます。
まず、シリコーンエラストマーベースを計量皿に注ぎます。シリコーン硬化剤を10対1の比率で添加し、混合物を十分に攪拌して、シリコーンポリマー鎖の適切な架橋を確保します。マスターモールドをシャーレに入れ、未硬化のPDMSをモールドに均等に注ぎます。
次に、ペトリ皿を真空デシケーター内に30分間入れて、混合物から泡を取り除きます。PDMSの硬化を完了するには、金型を摂氏70度に設定されたオーブンに90分間入れます。PDMSの硬化が完了したら、カミソリの刃やメスでマイクロ流体キャストを切り取ります。
チャネルの端に穴を開けます。次に、スライドガラスとエッチング面を上にしてマイクロ流体キャストをプラズマクリーナーに入れます。真空ポンプを始動し、チャンバーを密閉します。
次に、プラズマクリーナーを高設定に回し、セットアップをクリーナーに30秒間放置します。その後、プラズマクリーナーの電源を切り、掃除機を離します。プラズマ洗浄したキャストとスライドガラスを結合するには、プラズマクリーナーで上を向いていた側面をそっと押し合わせます。
マイクロ流体デバイスをオーブンまたは摂氏70度のホットプレートに10分間置き、結合プロセスを完了します。次に、マイクロ流体チャンバーを1型ウマ毛皮状コラーゲン試薬でコーティングし、指定された出口から指定された入口に送ります。コーティングされたコラーゲンがチャネル内で蒸発するのを防ぐために、デバイスは暖かく湿気の多い密閉容器に保管してください。
1時間後、コーティングとは反対方向にPBSでデバイスをすすぎ、コラーゲン溶液を洗い流します。まず、選択した蛍光色素を使用して、蛍光標識CD41抗体とクエン酸全血をインキュベートします。ナットロッカーで血液を30分間染色します。
次に、顕微鏡と関連ソフトウェアの電源を入れます。回収シリンジポンプを顕微鏡ステージと水平に設定し、実験要件に応じてシリンジポンプの設定を調整します。次に、マイクロ流体デバイスを顕微鏡ステージに置き、その端をステージにテープで貼り付けて動きを防ぎます。
次に、内径16分の1インチのチューブをエルボーコネクタに接続し、次に内径16分の1インチのコネクタを備えた10ミリリットルのシリンジに接続します。10ミリリットルのシリンジに滅菌PBSを入れ、シリンジポンプに接続します。次に、エルボーコネクタをマイクロ流体デバイスの出口に挿入します。
長さ約10cmのインレットラインを用意し、一方の端にエルボーコネクタ、もう一方の端に角度のついたカットを配置します。次に、インレットエルボーコネクタをデバイスインレットに接続し、インレットラインを角度付きホルダーに配置された廃マイクロ遠心チューブに配置します。10倍対物レンズを使用して、マイクロ流体デバイスのチャネルエッジに焦点を合わせます。
次に、PBSでラインをプライミングします。シリンジポンプを手動で進めて、PDMSまたは破片のチャネルをクリアします。チャネルの入口と出口の近くに障害物がないか確認してください。
次に、保存した画像キャプチャ設定を開くか、血液サンプル中のCD41抗体に対応する明視野チャネルと蛍光チャネルを使用して1〜2秒ごとにキャプチャされた時系列画像の新しい画像キャプチャ手順を作成します。ろ過したクエン酸血液サンプルを採取し、実験開始直前にピペッティングで上下に混合します。角度のついた微量遠心分離機ホルダーにサンプルを置きます。
次に、インレットラインを血液サンプルに配置し、画像キャプチャの記録を開始します。シリンジをゆっくりと引き出して、チューブ内のデッドボリュームを埋めます。血液がチャネルに到達したら、すぐにシリンジポンプの再生を押して、希望の速度で流れを再開します。
血小板がマイクロ流体デバイスの狭窄領域を完全に閉塞するまで、または実験のエンドポイント(通常は10分)まで実験を実行します。実験が完了したら、画像キャプチャを停止し、シリンジポンプを停止します。最後に、画像キャプチャを適切なストレージに保存します。
