Este método combina a capacidade de coloração para uma proteína de membrana, preservando também a integridade da membrana e a arquitetura subcelular. Então é realmente poderoso para localização precisamente de uma proteína associada à membrana. A principal vantagem desta técnica é que combina o uso de uma marca geneticamente clonável robusta, APEX2, com métodos de última geração na preservação celular para microscopia eletrônica, incluindo criofixação e substituição de congelamento.
Juntos, estes permitem uma localização precisa de proteínas dentro de uma célula bem preservada. Este protocolo pode ser usado para dissecar mecanismos pelos quais os vírus se replicam dentro da célula hospedeira. Vírus muitas vezes sequestram proteínas hospedeiras durante seu esquema de infecção.
Vírus são os pequenos genomas, que eles utilizam para se replicar dentro dessas células hospedeiras. Recentemente, conseguimos, em dados inéditos, rotular essas proteínas usando essa tecnologia para entender como os vírus se replicam. Essa técnica mostrou-se realmente crítica em um estudo colaborativo recente sobre uma toxina bacteriana que causa a quebra do golgi.
Usando crioAPEX, conseguimos localizar precisamente a toxina com as peças de golgi fragmentadas, algo que era realmente difícil de ver usando técnicas normais de imunofluorescência. Demonstrando essa técnica estará Elaine Mihelc, estudante de pós-graduação, e a pesquisadora Stephanie Angel, de nossos laboratórios. Depois de semear células HEK293 no prato, transfeme as células com plasmídeos de expressão de mamíferos marcados APEX2 usando reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.
Às 12-15 horas após a transfecção, lave as células uma vez com PBS. Em seguida, lave as células com PBS do prato em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar a 500 x g por cinco minutos.
Remova cuidadosamente o tampão de cacodilato de sódio supernante e suspenda a pelota em dois mililitros de 2%glutaraldeído e 0,1 tampão de cacodilato de sódio molar a pH 7,4 à temperatura ambiente. Coloque a amostra no gelo para incubar por 30 minutos. Em seguida, pelota a amostra a 500 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Lave a pelota três vezes por cinco minutos cada com dois mililitros de 0,1 amortecedor de cacodilato de sódio molar por centrifugação a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o supernante. Para realizar a reação peroxidase, lave a pelota suspendendo-a em três mililitros de solução DAB seguida de pelotização a 500 x g por cinco minutos.
Em seguida, suspenda novamente a pelota em três mililitros de solução DAB com peróxido de hidrogênio de 5,88 mililitros. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. A pelota torna-se visivelmente de cor marrom, indicando a presença do produto de reação DAB insolúvel.
Depois de lavar novamente com tampão de cacodilato de sódio no DMEM, de acordo com o manuscrito, suspenda novamente a pelota celular em 500 microliters de uma solução crioprotetora de DMEM contendo soro bovino 10% fetal e 15% de albumina de soro bovino bovino. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Pelota novamente, aumentando ligeiramente a velocidade da centrífuga de 500 x g.
Descarte a maioria do supernante, garantindo que restasse líquido suficiente para que a pelota não seque. Retire qualquer líquido restante da pelota da célula usando o canto de uma toalha de laboratório ou papel toalha. Deixe que o líquido suficiente permaneça que a pelota forme uma pasta, semelhante em consistência à pasta de dente.
Aspire de dois a três microliters da pelota celular e deposite-a em um portador de membrana. Encha completamente o poço do portador da membrana para que a tensão superficial crie uma pequena cúpula em cima. Deslize o porta-membrana para dentro do cartucho e fixe.
Coloque o cartucho na máquina HPF que foi preparada e preparada e pressione comece a congelar. Mantendo os cartuchos imersos em nitrogênio líquido, remova o porta-membranas de seu cartucho. Coloque em uma cápsula de plástico e coloque a cápsula de plástico em um Criovial cheio de nitrogênio líquido.
Em uma capa química, prepare um mililitro por amostra da solução de 0,2% de peso por volume de ácido tânnico e 5% dI em acetona em um Cryovial. Coloque-os em nitrogênio líquido para congelar. Coloque a mistura de substituição de congelamento um frasco e os Criovias contendo as pelotas de célula congelada na câmara de amostra das unidades de substituição de congelamento.
Transfira a cápsula interna contendo o portador da membrana do frasco de nitrogênio líquido para o frasco correspondente contendo mistura de substituição de congelamento. Inicie um protocolo de substituição de congelamento a 90 graus Celsius. Após 24 horas, pausa a substituição do congelamento e lave as amostras três vezes por cinco minutos com acetona que foi resfriada a 90 graus Celsius.
Em seguida, em uma capa química, prepare um mililitro por amostra de uma solução de 1%tetroxida de 1%osmium, acetato de 0,2%uranyl e 5% dI em acetona em um Cryovial e coloque-os em nitrogênio líquido para congelar. Coloque os Criovias com a mistura de substituição de congelamento dois na unidade de substituição de congelamento e transfira as cápsulas da terceira lavagem de acetona para a mistura de substituição de congelamento dois frascos. Incuba-os e congela a mistura de substituição dois por 72 horas a 90 graus Celsius, seguido de aquecimento gradual para zero graus Celsius ao longo de 12-18 horas.
Mantenha a temperatura em zero graus Celsius e adicione acetona pré-resfriada nos frascos para lavar três vezes por 10 minutos cada. Prepare uma mistura de resina de escolha em um béquer plástico de acordo com as instruções do fabricante e adicione 2%4% e 8% de resina nos frascos para imergir as cápsulas. Incubar por duas horas cada um a zero graus Celsius.
Em seguida, incubar em 15%30%60%90% e 100% componentes de resina de A, B e D apenas por quatro horas cada a temperatura ambiente. Após as 20 horas, prepare uma mistura de componentes de resina A, B, C e D e incubar por quatro horas. Coloque os portadores de membrana com pelotas celulares lado para cima em moldes planos de incorporação e encha com mistura de resina A, B, C e D.Coloque-os em um forno para polimerizar a 60 graus Celsius por 24-36 horas.
Após a polimerização, remova os blocos do molde e coloque a amostra no mandril vertical do ultra microtoma onde pode ser visualizado com ampliação. Separe o portador da membrana do bloco por uma combinação de nitrogênio líquido na membrana para separar o metal do plástico, e usando uma lâmina de barbear para cortar a resina ao redor do portador da membrana. Quando separado, levante suavemente o portador da membrana, deixando a cúpula de pelotas de célula na face do bloco.
Coloque o bloco com a pelota de célula exposta voltada para cima em um molde de incorporação plana que é ligeiramente mais profundo do que o primeiro molde e preencha com os componentes de resina A, B, C e D.Polymerize a 60 graus Celsius por 24-36 horas. Corte o bloco ao redor da pelota da célula usando uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque o bloco no mandril de amostra no braço de secção de um ultra microtoma.
Usando uma faca de vidro ou diamante, corte o bloco em uma forma trapezoidal perto da pelota celular. Obtenha 90 seções ultra finas de nanômetros da pelota celular usando uma faca de vidro ou diamante. Pegue uma fita de seções em uma grade TEM.
Seque a grade manchando a borda em um pedaço de papel filtro e armazene-a em uma caixa de armazenamento de grade TEM. Monte a grade no suporte TEM e coloque o suporte no microscópio. Use um Tecnai T12 a 80 kilovolts para triagem de amostras crioAPEX.
Adquira imagens de células e estruturas subcelulares de interesse com rotulagem APEX2. Neste estudo, a preparação da amostra pelos métodos tradicionais de APEX resultou em rotulagem clara de estruturas de órticulo endoplasmático organizados e suaves. Na alta ampliação, as membranas empilhadas pareciam babadas e lacunas não uniformes estavam presentes entre densidades de membrana concêntrica, indicando má preservação da membrana e extração lipídica.
A amostra preparada pela crioAPEX também tinha rotulagem claramente definida de estruturas de rétilum organizado e suave, porém, as membranas eram lisas e paralelas e pouco ou nenhuma extração lipídica foi vista. A análise tem de 90 nanômetros de seções finas revelou que a proteína interativa de levedura huntington E estava presente em todo o tiquelum endoplasmático periférico, bem como o envelope nuclear. Além disso, a densidade de proteína interativa da levedura huntington E foi resolvida em focos regularmente espaçados ao longo da membrana endoplasmática luminal.
A distribuição e os focos de proteína e proteína de Huntington também foram visíveis em uma amostra preparada com fixação e desidratação tradicionais. No entanto, foram presentes extensas interrupções e extrações de membrana, tornando a amostra subótima. A rotulagem APEX2 foi realizada utilizando-se três marcadores celulares, dos quais mito-V5-APEX2 forneceu uma coloração específica apenas de mitocôndrias e CAAX-APEX2 produziu uma coloração distinta apenas da membrana plasmática.
Não foi observada rotulagem em organelas intracelulares. A coloração do lúmen golgi também foi avaliada usando um marcador Alpha MAN2-APEX2, conforme descrito em nosso manuscrito sengupta et al original. Após este procedimento, métodos tridimensionais como tomografia eletrônica ou microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focalizada podem ser realizados a fim de investigar a distribuição 3D de uma proteína de interesse.
Muitos dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos, por isso, antes do uso, as folhas de dados de segurança devem ser consultadas para garantir que os produtos químicos sejam manuseados usando equipamentos de proteção individual adequados e descartados de acordo com as diretrizes institucionais.
