Этот метод сочетает в себе способность окрашивать мембранный белок, сохраняя при этом целостность мембраны и субклеточную архитектуру. Так что это действительно мощный для точной локализации мембраны связанных белка. Основным преимуществом этой техники является то, что она сочетает в себе использование надежного генетически клонируемого тега APEX2 с самыми художественными методами в клеточном сохранении для электронной микроскопии, включая криофиксацию и замену замораживания.
Вместе они позволяют точно локализации белка в хорошо сохранившихся клеток. Этот протокол может быть использован для вскрытия механизмов, с помощью которых вирусы размножаются внутри клетки-хозяина. Вирусы часто будет захватить принимающих белков во время их инфекции схеме.
Вирусы являются небольшими геномами, которые они используют для репликации внутри этих клеток-хозяек. В последнее время мы смогли в неопубликованных данных, этикетки этих белков с помощью этой технологии, чтобы понять, как вирусы реплицируются. Этот метод оказался очень важным в недавнем совместном исследовании бактериального токсина, который вызывает golgi распада.
Используя криоАПЕКС, мы смогли точно локализовать токсин с фрагментированными кусочками голги, то, что было действительно трудно увидеть иначе с помощью нормальных методов иммунофторесценции. Демонстрацией этой техники будет Элейн Михенц, аспирантка и научный сотрудник Стефани Ангел из наших лабораторий. После посева клеток HEK293 в блюде, трансфект клеток с APEX2 помечены млекопитающих выражение плазмидов с использованием трансфекции реагент в соответствии с указаниями производителя.
В 12-15 часов после трансфекции, мыть клетки один раз с PBS. Затем смойте клетки с PBS из блюда в 15 миллилитров конической трубки. Центрифуга по 500 х г в течение пяти минут.
Аккуратно удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в двух миллилитров 2%glutaraldehyde и 0,1 молярного буфера какодилата натрия при рН 7.4 при комнатной температуре. Поместите образец на лед, чтобы инкубировать в течение 30 минут. Затем, гранулы образца на 500 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.
Вымойте гранулы три раза в течение пяти минут каждый с двумя миллилитров 0,1 молярного буфера какодилата натрия путем центрифугирования при четырех градусах по Цельсию. После центрифугации удалите супернатант. Для выполнения реакции пероксидазы, мыть гранулы путем повторного приостановления в трех миллилитров раствора DAB следуют гранулирования на 500 х г в течение пяти минут.
Затем повторно приостанавливайте гранулы в трех миллилитров раствора DAB с 5,88 миллимолярной перекисью водорода. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Гранулы становятся заметно коричневого цвета, что указывает на наличие нерастворимого продукта реакции DAB.
После мытья снова с буфером какодилата натрия в DMEM, согласно рукописи, re-suspend гранулы клетки в 500 microliters криопротекторного раствора DMEM содержа сыворотку быта плода и 15%bovine альбумин сыворотки. Перенесите подвеску клетки в 0,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку. Пеллет снова, немного увеличивая скорость центрифуги от 500 х г.
Откажитесь от большинства супернатантов, гарантируя, что достаточно жидкости остается так, чтобы гранулы не высохли. Wick от любой оставшейся жидкости из ячейки гранулы с помощью угла лабораторной салфетки или бумажное полотенце. Пусть остается достаточно жидкости, что гранулы образует пасту, похожую по консистенции на зубную пасту.
Аспирировать от двух до трех микролитров клеточной гранулы и депонировать его на мембрану перевозчика. Заполните колодец мембранного носителя полностью так, чтобы поверхностное натяжение создало небольшой купол сверху. Сдвиньте мембрану носителя в картридж и безопасной.
Поместите картридж в машину HPF, которая была подготовлена и загрунтовка и нажмите начать замерзать. Сохраняя картриджи погруженными в жидкий азот, удалите мембранный носитель из картриджа. Поместите в пластиковую капсулу и поместите пластиковую капсулу в Криовиал, полный жидкого азота.
В химическом капюшоне, подготовить один миллилитр на образец раствора 0,2%вес по объему дубовой кислоты и 5%DI воды в ацетоне в Cryovial. Поместите их в жидкий азот, чтобы заморозить. Поместите заморозить замену смеси один флакон и Cryovials содержащие замороженные гранулы ячейки в заморозить единиц образца камеры.
Перенесите внутреннюю капсулу, содержащую мембранный носитель, из жидкого азотного флакона в соответствующий флакон, содержащий смесь замораживания замены. Начало протокола замены замораживания при 90 градусах по Цельсию. Через 24 часа приохладьте замену замораживания и трижды промойте образцы в течение пяти минут ацетоном, который охлаждается до 90 градусов по Цельсию.
Далее, в химическом капюшоне, подготовить один миллилитр на образец раствора 1%osmium тетроксида, 0,2% ацетата урана и 5%DI воды в ацетоне в Cryovial и поместить их в жидкий азот, чтобы заморозить. Поместите Cryovials с замораживанием замены смеси два в блок замораживания замены и передачи капсулы из третьего ацетона мыть в заморозить замены смеси два флакона. Инкубировать их и заморозить замену перемешать два в течение 72 часов при 90 градусах по Цельсию, а затем постепенное потепление до нуля градусов по Цельсию в течение 12-18 часов.
Держите температуру при нулевом градусе по Цельсию и добавьте предварительно охлажденный ацетон во флаконы, чтобы мыть три раза в течение 10 минут каждый. Подготовка смолы смесь выбора в пластиковый стакан в соответствии с указаниями производителя и добавить 2%4% и 8% смолы во флаконы, чтобы погрузить капсулы. Инкубировать в течение двух часов каждый при нулевом градусе по Цельсию.
Затем инкубировать в 15%30%60%90%и 100%смолы компонентов A, B и D только в течение четырех часов каждый при комнатной температуре. После 20 часов, подготовить смесь компонентов смолы A, B, C, и D и инкубировать в течение четырех часов. Поместите мембранные носители с клеточной гранулой вверх в плоские встраивающие формы и заполните смесью смолы A, B, C и D.Поместите их в духовку для полимеризации при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 24-36 часов.
После полимеризации удалите блоки из формы и поместите образец в вертикальный патрон ультра микротомы, где его можно визуализировать с увеличением. Отделить мембрану перевозчика от блока путем сочетания dabbing жидкого азота на мембране перевозчика отделить металл от пластика, и с помощью лезвия бритвы чип от смолы вокруг мембраны перевозчика. При разделении аккуратно смахите мембранный носитель, оставив купол клеточных гранул на лице блока.
Поместите блок с открытыми клеточными гранулами, обращенными вверх, в плоскую встраиваемую форму, которая немного глубже, чем первая плесень, и заполните компонентами смолы A, B, C и D.Polymerize при 60 градусах по Цельсию в течение 24-36 часов. Обрезать блок вокруг ячейки гранулы с помощью лезвия бритвы. Затем поместите блок в образец патрона на секционизивную руку ультра микротомы.
Используя стеклянный или алмазный нож, обрежьте блок в трапециевидную форму, тесно окружающую клеточные гранулы. Получить 90 нанометров ультра тонкие секции ячейки гранулы с помощью стекла или алмазного ножа. Возьмите ленту секций на сетке TEM.
Высушите сетку, помяв край на листе фильтровальной бумаги и храните ее в ящике для хранения сетки TEM. Намонтировать сетку на держателе TEM и поместить держатель в микроскоп. Используйте Tecnai T12 на 80 киловольт для скрининга образцов криоАПЕКС.
Приобретайте изображения клеток и субклеточных структур, представляющих интерес, с помощью маркировки APEX2. В этом исследовании подготовка образца традиционными методами APEX привела к четкой маркировке организованных, гладких эндоплазмических структур стикулума. При высоком увеличении сложенные мембраны казались взъерошенными, а не однородные зазоры присутствовали между концентрической плотностью мембран, что указывает на плохое сохранение мембран и извлечение липидов.
Образец, подготовленный cryoAPEX, также имел четко определенную маркировку организованных, гладких эндоплазмических структур стикулума, однако мембраны были гладкими и параллельными, и практически не было замечено извлечения липидов. Анализ ТЕМ тонких секций 90 нанометров показал, что хантингтонские дрожжи, взаимодействующие с белком Е, присутствовали на периферической эндоплазмической цитикулуме, а также в ядерной оболочке. Кроме того, Хантингтон дрожжей взаимодействующих белка E плотность была решена в регулярно-пространственные очаги вдоль светимой эндоплазмической мембраны стикулум.
Хантингтон дрожжей взаимодействующих белка E распределения и очаги были также видны в образце, подготовленном с традиционной фиксации и обезвоживания. Тем не менее, обширные нарушения мембраны и экстракции присутствовали, что делает образец неоптимальным. Маркировка APEX2 проводилась с использованием трех клеточных маркеров, из которых мито-V5-APEX2 обеспечивала специфическое окрашивание только митохондрий, а CAAX-APEX2 производила отдельное окрашивание только плазменной мембраны.
В внутриклеточных органеллах маркировки не наблюдалось. Окрашивание волчанки голги также оценивалось с помощью маркера Alpha MAN2-APEX2, описанного в нашей оригинальной рукописи Sengupta et al. После этой процедуры, трехмерные методы, такие как электронная томография или сфокусированная ионная лучевая сканирующая электронная микроскопия могут быть выполнены для того, чтобы исследовать 3D распределение белка, представляющий интерес.
Многие химические вещества, используемые в этом протоколе, являются токсичными, поэтому перед использованием следует проконсультироваться с листами данных о безопасности для обеспечения того, чтобы химические вещества обрабатывались с использованием надлежащего средства индивидуальной защиты и утилизируются в соответствии с институциональными руководящими принципами.
