Diese Methode kombiniert die Fähigkeit, ein Membranprotein zu färben und gleichzeitig die Membranintegrität und subzelluläre Architektur zu erhalten. Es ist also wirklich mächtig, um ein membranassoziiertes Protein präzise zu lokalisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung eines robusten genetisch klonbaren Tags, APEX2, mit modernsten Methoden in der zellulären Konservierung für die Elektronenmikroskopie kombiniert, einschließlich Kryofixierung und Gefriersubstitution.
Zusammen ermöglichen diese eine präzise Proteinlokalisierung innerhalb einer gut erhaltenen Zelle. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Mechanismen zu sezieren, durch die Viren innerhalb der Hostzelle replizieren. Viren werden oft Host-Proteine während ihrer Infektion sanieren.
Viren sind die kleinen Genome, die sie nutzen, um sich in diesen Wirtszellen zu replizieren. Kürzlich konnten wir in unveröffentlichten Daten diese Proteine mit dieser Technologie kennzeichnen, um zu verstehen, wie sich Viren vermehren. Diese Technik erwies sich als wirklich kritisch in einer kürzlich durchgeführten kollaborativen Studie über ein bakterielles Toxin, das den Golgi-Abbau verursacht.
Mit kryoAPEX konnten wir das Toxin mit den fragmentierten Golgi-Stücken präzise lokalisieren, was sonst mit normalen Immunfluoreszenztechniken wirklich schwer zu erkennen war. Diese Technik wird Elaine Mihelc, Studentin, und wissenschaftliche Mitarbeiterin Stephanie Angel aus unseren Labors demonstrieren. Nach der Aussaat von HEK293-Zellen in der Schale, transfezieren Sie die Zellen mit APEX2 getaggt Säugetier Expression Plasmide mit Transfektion Reagenz nach den Anweisungen des Herstellers.
Nach 12-15 Stunden nach der Transfektion die Zellen einmal mit PBS waschen. Dann die Zellen mit PBS von der Schale in ein 15 Milliliter konisches Rohr abwaschen. Zentrifuge bei 500 x g für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und hängen Sie das Pellet in zwei Millilitern 2%glutaraldehyd und 0,1 molar Natriumkakodylatpuffer bei pH 7,4 bei Raumtemperatur wieder auf. Legen Sie die Probe auf Eis, um sie 30 Minuten lang zu bebrüten. Dann pellet die Probe bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie das Pellet dreimal für jeweils fünf Minuten mit zwei Millilitern 0,1 Mol-Natrium-Cakodylat-Puffer durch Zentrifugieren bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand. Um die Peroxidase-Reaktion durchzuführen, waschen Sie das Pellet, indem Sie es in drei Milliliter DAB-Lösung wieder aufhängen, gefolgt von Pellets bei 500 x g für fünf Minuten.
Dann setzen Sie das Pellet in drei Milliliter DAB-Lösung mit 5,88 Millimolar Wasserstoffperoxid wieder auf. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Pellet wird sichtbar braun gefärbt, was auf das Vorhandensein des unlöslichen DAB-Reaktionsprodukts hinweist.
Nach dem erneuten Waschen mit Natrium-Cacodylat-Puffer in DMEM, nach dem Manuskript, re-suspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter einer kryoprotektorischen Lösung von DMEM enthält 10%fetales Rinderserum und 15%rinderserumalbumin. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Pellet wieder, leicht Erhöhung der ZentrifugeGeschwindigkeit von 500 x g.
Entsorgen Sie den Großteil des Überstandes, um sicherzustellen, dass genügend Flüssigkeit übrig bleibt, damit das Pellet nicht austrocknet. Entfernen Sie alle verbleibenden Flüssigkeiten aus dem Zellpellet mit der Ecke eines Labortuchs oder Papiertuchs. Lassen Sie genügend Flüssigkeit übrig, dass das Pellet eine Paste bildet, ähnlich in der Konsistenz wie Zahnpasta.
Zwei bis drei Mikroliter des Zellpellets aspirieren und auf einen Membranträger ablagern. Füllen Sie den Brunnen des Membranträgers vollständig, so dass die Oberflächenspannung eine leichte Kuppel auf der Oberseite erzeugt. Schieben Sie den Membranträger in die Patrone und sichern Sie sie.
Legen Sie die Patrone in die vorbereitete und grundierte HPF-Maschine und lassen Sie das Einfrieren ein. Halten Sie die Patronen in flüssigen Stickstoff eingetaucht, entfernen Sie den Membranträger aus seiner Kartusche. In eine Plastikkapsel geben und die Plastikkapsel in ein Kryovial voller flüssigen Stickstoffs geben.
In einer chemischen Haube einen Milliliter pro Probe der Lösung von 0,2% Volumenvolumen-Bräunungssäure und 5%DI-Wasser in Aceton in einem Kryovial vorbereiten. Legen Sie sie in flüssigen Stickstoff zum Einfrieren. Legen Sie die Gefriersubstitutionsmischung eine Durchstechflasche und die Cryovials mit den gefrorenen Zellpellets in die Probenkammer der Gefriersubstitutionseinheiten.
Übertragen Sie die innere Kapsel, die den Membranträger enthält, aus der flüssigen Stickstoffdurchstechflasche in die entsprechende Durchstechflasche mit Gefriersubstitutionsmix ein. Starten Sie ein Freeze-Substitutionsprotokoll bei 90 Grad Celsius. Nach 24 Stunden die Gefriersubstitution anhalten und die Proben dreimal fünf Minuten lang mit auf 90 Grad Celsius abgekühltem Aceton waschen.
Als nächstes, in einer chemischen Haube, bereiten Sie einen Milliliter pro Probe einer Lösung von 1%Osmiumtetroxid, 0,2%Uranylacetat und 5%DI-Wasser in Aceton in einem Kryovial vor und legen Sie sie in flüssigen Stickstoff ein, um einzufrieren. Legen Sie die Cryovials mit der Gefriersubstitution zwei in die Gefriersubstitutionseinheit und übertragen Sie die Kapseln aus dem dritten Acetonwaschen in die Gefriersubstitutionsmischung zwei Fläschchen. Inkubieren sie und gefrieren Substitution mischen zwei für 72 Stunden bei 90 Grad Celsius, gefolgt von einer allmählichen Erwärmung auf null Grad Celsius über 12-18 Stunden.
Halten Sie die Temperatur bei null Grad Celsius und fügen Sie vorgekühltes Aceton in die Fläschchen, um dreimal für jeweils 10 Minuten zu waschen. Bereiten Sie eine Harzmischung der Wahl in einem Kunststoffbecher nach den Anweisungen des Herstellers vor und fügen Sie 2%4% und 8% Harz in die Durchstechflaschen ein, um die Kapseln einzutauchen. Zwei Stunden bei null Grad Celsius inkubieren.
Dann in 15%30%60%90% und 100%Harzkomponenten von A, B und D nur für jeweils vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Nach den 20 Stunden eine Mischung aus den Harzkomponenten A, B, C und D zubereiten und vier Stunden lang inkubieren. Die Membranträger mit Zellpelletseite in flache Einbettformen geben und mit Harzmischung A, B, C und D. in einen Ofen stellen, um sie 24-36 Stunden lang bei 60 Grad Celsius zu polymerisieren.
Nach der Polymerisation entfernen Sie die Blöcke aus der Form und legen Sie die Probe in das vertikale Futter des Ultramikrotome, wo sie mit Vergrößerung visualisiert werden kann. Trennen Sie den Membranträger vom Block durch eine Kombination aus dabbing flüssigem Stickstoff auf dem Membranträger, um das Metall vom Kunststoff zu trennen, und verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Harz um den Membranträger zu zerschipen. Heben Sie den Membranträger nach der Trennung vorsichtig ab und lassen Sie die Zellpelletkuppel auf der Fläche des Blocks zurück.
Platzieren Sie den Block mit dem freiliegenden Zellpellet nach oben in einer flachen Einbettform, die etwas tiefer als die erste Form ist, und füllen Sie ihn mit den Harzkomponenten A, B, C und D.Polymerize bei 60 Grad Celsius für 24-36 Stunden. Schneiden Sie den Block um das Zellpellet mit einer Rasierklinge. Legen Sie dann den Block in das Probenfutter auf den Schnittarm eines Ultramikrotomes.
Mit einem Glas- oder Diamantmesser den Block in eine trapezförmige Form schneiden, die das Zellpellet dicht umgibt. Erhalten Sie 90 Nanometer ultradünne Abschnitte des Zellpellets mit einem Glas- oder Diamantmesser. Nehmen Sie ein Band von Abschnitten auf einem TEM-Raster auf.
Trocknen Sie das Gitter, indem Sie die Kante auf ein Stück Filterpapier bättchen und in einer TEM-Gitteraufbewahrungsbox aufbewahren. Montieren Sie das Gitter am TEM-Halter und legen Sie den Halter in das Mikroskop. Verwenden Sie einen Tecnai T12 bei 80 Kilovolt zum Screening von KryoAPEX-Proben.
Erfassen Sie Bilder von Zellen und subzellulären Strukturen von Interesse mit APEX2-Beschriftung. In dieser Studie führte die Herstellung der Probe nach traditionellen APEX-Methoden zu einer klaren Kennzeichnung organisierter, glatter endoplasmatischer Retikulumstrukturen. Bei hoher Vergrößerung traten die gestapelten Membranen rüpelhaft auf und es entstanden ungleichmäßige Lücken zwischen konzentrischen Membrandichten, was auf eine schlechte Membrankonservierung und Lipidextraktion hindeutet.
Die von cryoAPEX hergestellte Probe hatte auch eine klar definierte Kennzeichnung organisierter, glatter endoplasmatischer Retikulumstrukturen, jedoch waren die Membranen glatt und parallel und es wurde wenig bis gar keine Lipidextraktion beobachtet. Die TEM-Analyse von 90 Nanometer dünnen Abschnitten ergab, dass das Huntington-Hefe-interagierende Protein E im gesamten peripheren endoplasmatischen Retikulum sowie in der Kernhülle vorhanden war. Zusätzlich wurde die Huntington-Hefe-interagierende Protein-E-Dichte entlang der luminalen endoplasmatischen Retikulummembran in regelmäßig verteilte Brennpunkte aufgelöst.
Huntington-Hefe interagierende Protein E Verteilung und Brennpunkte waren auch in einer Probe mit traditioneller Fixierung und Dehydrierung vorbereitet sichtbar. Es gab jedoch umfangreiche Membranstörungen und Extraktionen, was die Probe suboptimal machte. Die APEX2-Kennzeichnung wurde mit drei zellulären Markern durchgeführt, von denen Mito-V5-APEX2 nur eine spezifische Färbung von Mitochondrien vorsah und CAAX-APEX2 nur eine deutliche Färbung der Plasmamembran erzeugte.
Bei intrazellulären Organellen wurde keine Kennzeichnung beobachtet. Die Färbung des Golgi-Lumens wurde auch mit einem Alpha MAN2-APEX2-Marker bewertet, wie in unserem ursprünglichen Sengupta et al-Manuskript beschrieben. Im Anschluss an dieses Verfahren können dreidimensionale Methoden wie Elektronentomographie oder fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt werden, um die 3D-Verteilung eines von Interesse sindden Proteins zu untersuchen.
Viele der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind giftig, daher sollten sicherheitsdatenblätter vor der Verwendung konsultiert werden, um sicherzustellen, dass die Chemikalien mit ordnungsgemäßer persönlicher Schutzausrüstung behandelt und gemäß den institutionellen Leitlinien entsorgt werden.
