我々の方法は、平均的な生化学者が固定化された金属親和性クロマトグラフィーを使用して分離されたサンプルが遷移金属で汚染されているかどうかを迅速に判断することを可能にするので、重要である。主な利点は、アッセイを行うことができる容易さです。このアッセイは、ほとんどの生化学ラボに共通する計器と技術を使用しており、簡単かつ迅速に実装できます。
この記事では、ニッケル NTA カラムで分離されたサンプルにこの方法を適用しますが、この方法は他の金属アフィニティ樹脂と共に使用できます。初めてユーザーは、既知の濃度のニッケルストック溶液でこの方法を試してみてください。これにより、スペクトルの変化に示されたワークフロー、サンプルカラー、および樹脂に慣れ親しみます。
手順を実証するには、私の研究室の技術者コール・スウェインです。まず、UV-Vis分光光度計をオンにしてウォームアップします。280ナノメートルの光吸光度を有するダイオードアレイUV-Vis分光光度計を用いて、タンパク質を定量化する測定対象のクロマトグラフィー画を決定する。
トリス、HEPES、MOPS、リン酸緩衝液など、7~12の間のPHを有する10~100ミリモルのサンプルバッファーを得る。調製したストック溶液の1ミリリットルごとに120ミリグラムのHNB試薬を用いて、サンプルバッファー内のHNB分散液の体積分量で12%の重量を調製する。647ナノメートルでデータを収集するために分光光度計を設定します。
サンプルバッファーで満たされたクベットを使用して、分光光度計をブランクにします。合計アッセイ量のミリリットル当たり50マイクロリットルのHNBストックを含むキュベットで制御溶液を調製します。コントロールを室温で最低3分間インキュベートします。
コントロールサンプルの吸光度を647ナノメートルで測定し、記録します。サンプルバッファーと適切に希釈したタンパク質画分の 2850 マイクロリットルと HNB ストックの 150 マイクロリットルを混合することによってアッセイサンプルを準備します。サンプルを室温で最低3分間インキュベートします。
測定する各分数について、スペクトル記録を繰り返します。希釈が不十分な場合には、647ナノメートルでの全スペクトルバンドがなくなっている。あまりにも強い希釈を伴いながら、サンプルはコントロールと区別できません。
各サンプル中の金属の濃度を決定するために、まずHNB制御から647ナノメートルで各サンプル吸光度の差を見つける。DFがアッセイ画分の希釈因子である式を用いてマイクロモル中の金属濃度を決定し、デルタA-B-S 647は647ナノメートルでの吸光度変化、負の2に対する3.65倍の10倍はHNBの絶滅係数を表し、lはクベットの光学経路をセンチメートルで表す。本研究では、MSP1E3D1の単離からニッケルイオンに対してアッセイされた画分の代表的スペクトルにおける中性PHにおける遊離HNBのスペクトルをここに示す。
HNB制御と比較して647ナノメートルでの吸光度の低下が観察され、これは遷移金属の存在下でのHNB複合体の形成に対応した。このアッセイの応用を実証するために、2つのタグ付き膜足場タンパク質、MSP1E3D1、MSP2N2、およびジオバクター硫黄減少から、新規の3ヘム、c型シトクロムGSU0105を分析した。GSU0105の各画分のタンパク質とニッケルイオン含有量は互いに有意にシフトし、最もタンパク質を含むMSP1E3D1およびMSP2N2の画分もニッケル含有量が最も高かった。
また、動員された金属親和クロマトグラフィーを用いて収集した分画の中で金属含有量が均等に分布しないことも示した。すべてのサンプルでブランクを適切かつ一貫して混合し、すべてのサンプルでブランクのインキュベーション時間を均等にすることが最も重要です。特に関心のあるタンパク質の分画は、原子吸光分析またはICPMSでさらに分析して、金属汚染を確認し、キレートまたは強結合タンパク質金属イオンを検査することができます。
遷移金属浸出検出以外にも、この技術は、タンパク質への遷移金属イオンの結合親和性を測定するために使用することができます。試料中に存在するHNBおよび任意のニッケルは、それぞれ眼および皮膚に刺激を与える。手袋と目の保護を含む標準PPEは、方法の間に使用する必要があります。
