私たちのシンプルで実用的な方法論は、体外でPVATの藍化を研究するための豊富なADSCSを得るために、肥満および関連する心血管疾患に対するテストの正常な薬物に使用することができる。この方法の利点は、FACS、または磁気活性化細胞の並べ替えのためのflou-クロム共役抗体で細胞にラベルを付ける必要があるビオチンのNCADSCの固有の蛍光です。この方法は、外因性から神経堤細胞由来の豊富なADSCを取得してPVAT脂肪生成、またはインビトロでの脂肪生成を研究するために使用することができる。
若いマウスを使用し、焼灼および誘発された異状形成の経験を有することは、3T3細胞がこのプロトコルの成功に不可欠であることを意味する。この手順のデモンストレーションは、大学院生のイディン・チーと、私の研究室の技術者であるリアン・シューです。PAAT解剖の場合、マウスの死骸を75%エタノールで5分間殺菌した後、はさみを使って腹部の皮膚を切り取り、分離する。
骨盤から首に腹側の正線に沿ってカットし、腹部を開きます。肝臓を動かして横隔膜を露出させ、正中線の両側の横隔膜と肋骨を切ります。肋骨を剥がして心臓と肺を露出する。
そして、肺と胸腺を取り除く。大大ターと心臓と一緒にPAATをシャーレに抽出します。そして、心臓を取り除くために大動脈根で大動脈を切断します。
次に大動脈弓と下り大動脈の間に切り口を作ります。両方の構造を取り囲む脂肪組織と、後胸壁から左右の一般的な頸動脈を慎重に分離する。PAATを根から分離し、より大きな血管として慎重に、血管壁細胞の存在がFACS効率に影響を与え得ることが重要である。
氷冷HBSSバッファーを含むシャーレに組織を入れます。そして、できるだけ多くの脈管構造と筋膜を取り除くために無菌鉗子を使用してください。次いで、脂肪組織を2ミリリットルのエペンドルフチューブに移し、氷の上に5ミリリットルの氷冷HBSSバッファーを含む。
すべてのPAATが収集されたら、収穫した脂肪組織を、作りたての消化培地を1ミリリットル含む新しい2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。そして、組織をミンチするために外科用ハサミを使用してください。9ミリリットルの新鮮な消化媒体を含む50ミリメートルのチューブに組織スラリーを移す。
そして、組織を10回トリチュレートするために1ミリリットルのピペットを使用してください。均質な溶液が得られたら、30〜45分間摂氏37度、1分あたり100回転、5分から10分ごとに消化不良を防ぎます。軽い黄色の均質な脂肪組織溶液が管の穏やかな渦巻き時に観察できる場合、10%の胎児ウシ血清を補充した5ミリリットルのHDMEMで消化を止める。
十分に混合した後、脂肪組織試料を遠心分離する。この間質血管細胞分画は、褐色がかったペレットとして見える。ペレットを10ミリリットルの培養培地で再懸濁し、70マイクロメートルの細胞ストレーナーを介して細胞懸濁液を濾過する。
別の遠心分離によって細胞を収集します。そして、5ミリリットルの赤血球リシスバッファー中にペレットを穏やかに再中断します。懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。
10分後、PBSの10ミリリットルで2回の遠心分離で反応を停止し、1%の胎児のウシ血清を補充する。第2遠心分離後、氷上の培養培地を5ミリリットルに再懸濁する。そして、最終的な遠心分離で細胞を収集します。
次いで、細胞を計数用のFACSバッファーの5ミリリットルで再懸濁する。NCADSC培養を設定するには、標準プロトコルに従ってFACSによって分離した後、各ウェルに5倍の10倍の3番目の細胞センチメートルの濃度、12のウェル培養プレートを配置します。37°Cで不完全な培養培地、20〜24時間の間に5%の二酸化炭素。
翌日、細胞を37°CPBSで洗浄し、新鮮な培養培地で培養液を供給する。培養が80〜90%の合流度に達したら、摂氏37度で3〜5分間、1ウェルあたり0.25%トリプシンEDTAの2ミリリットルで細胞を治療する。細胞がプレートの底部から剥離されたら、培養培地を2ミリリットルで酵素を中和し、遠心分離により採取した細胞を回収する。
ペレットをカウント用の新鮮な培養培地の1ミリリットルに再懸濁する。そして、新しい12ウェル培養プレートに5倍の10〜3番目の細胞/センチメートル平方濃度で播種します。次いで、残りの細胞を培地中に10%ジメチルスルホキシドを添加し、液体窒素中で凍結保存する。
卵胞分化を誘導するために、細胞が80〜90%の合流度に達した場合、必要に応じて2日間、褐色または白色のアディポジェニック誘導培地で細胞を治療する。インキュベーションの最後に、PBSで細胞を2回静かに洗浄してから、適切な新鮮な希釈誘導培地を各ウェルに添加し、さらに3〜5日間の培養器に細胞を戻します。培養されたNCADSCは、培養の7〜8日後に80〜90%の合流度に達する。
そして、形態のような拡大されたガラス繊維を実証する。さらにそれらの有数化の可能性を確認するために、分化したNCADSCsのオイルレッド染色を行い、成熟したアディポサイトを検出することができる。典型的には、成熟したアディポサイトは、8日間の白または褐色のアディポジェニック誘導の後に観察され、60%以上のNCADSCが異分化を呈する。
NCADSCsは、過渡後のアディポジェニックポテンシャルを大幅に低下させることに注意してください。免疫ブロッティングおよび定量的リアルタイムPCRは、8日間の白色脂質誘発の後、アディポサイト特異的な相対タンパク質および遺伝子の発現が、アディポジェニック分化されたNCADSCにおいて有意に増加することを明らかにした。同様に、藍細胞特異的遺伝子の発現、および褐色のアディポサイト特異的遺伝子は、8日間の褐色脂質誘発の後にも有意に増加する。
ほとんどのNCADSC絶縁プロトコルは単純で経済的で、抗体の使用を必要としないため、IFPの強い流体理由強度はFACSの栄養効率を向上させることができます。
