このプロトコルは、マウスモデルにおける癌異種の標的放射線療法に事前に標的化された方法論を適用する方法を記述する。事前標的型放射線免疫療法またはPRITは、抗体と放射性リガンドを別々に注入し、クリックケミストリーを使用して2つをインビボで結合することを可能にします。大腸癌の異種モデルを用いたPRITを提示する一方で、この技術はあらゆる表面抗原標的抗体に適用することができる。
これらはアプローチの有効性を低下させることができるので、急速に内部化しない抗原または広範囲に流さない抗原を選択することが重要である。huA33-TCOを合成するには、まず1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブ中の乾燥メチルホルムアミド中に、1ミリリットルTCO-NHS当たり40ミリグラムの125マイクロリットル溶液を調製する。この溶液は、将来の実験で使用するために80°Cで凍結することができます。
別の1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブでは、1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水でhuA33のミリリットル溶液あたり5ミリグラムを調製する。0.1モル炭酸ナトリウムの小さなアリコートを使用して、抗体溶液のpHを8.8~9.0の間に調整します。pH紙またはマイクロ電極を備えたpHメーターを使用してpHを監視し、pHが9.0を超えないことを確認します。
抗体溶液にTCO-NHSの40モル等価性に相当する体積を加える。疎水性TCO-NHSの沈殿を防ぐために、ゆっくりと攪拌して添加する。温和な撹拌機で摂氏25度で1時間、反応を可能にします。
事前にパックされた使い捨てサイズ除外脱塩カラムを使用してhuA33-TCO免疫コンジュゲートを精製する前に、サプライヤーが説明するサイズ除外カラムを平衡化し、通常はカラムの体積に対応するPBSの体積でカラムを5回洗浄する貯蔵中にカラムに存在する防腐剤を除去する。反応混合物の体積を示すサイズ除外カラムに反応混合物を加える。反応混合物が列に入った後、適切な量のPBSを加えて、カラムに加えた溶液の総容積を最大2.5ミリリットルにする。
溶出物としてPBSの2ミリリットルを使用して製品を収集します。280ナノメートルで波長を監視するUV vis分光光度計を用いてhuA33-TCOの濃度を測定します。より高濃度の免疫コンジュゲートを有する溶液が望ましい場合は、メーカーの指示に従って50,000分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いてhuA33-TCO溶液を濃縮する。
完成したhuA33-TCO免疫コンジュゲートを暗闇の中で摂氏4度で保管してください。将来4日以上使用する場合は、暗闇の中で摂氏80度で保管してください。1.7ミリリットルの遠心分離管で、pH 5.5に調整された0.25モル酢酸アンモニウムバッファーの200マイクロリットルを追加します。
バッファー溶液に塩化ルテチウム-177の所望の量を加えます。添加量は、実験中の被験者数と投与される放射性用量に依存する。DMSOにテトラジンPEG7-DOTAを添加して放射性混合物を混合します。
追加される量は、テスト対象の数によって異なります。溶液を摂氏37度で20分間インキュベートします。50 ミリモル EDTA pH 5.5 をモバイル相として使用したラジオインスタント薄層クロマトグラフィーを使用して、放射ラベルが完了していることを確認します。
ラベル付きルテチウム-177-DOTA-PEG7-テトラジンはベースラインに残り、無料のルテチウム-177はEDTAによって調整され、溶媒フロントと一緒に移動します。皮下腫瘍の配置は、あなたの拘束技術を妨げないことが重要です。私はあなたの拘束手とは反対の側面にそれらを置くことをお勧めします。
左手で拘束するので、右脇腹に腫瘍を置くことを選びました。大腸癌異種グラフを持つ女性の高胸腺ヌードマウスを並べ替え、各コホートの平均腫瘍容積がほぼ等しくなるようにする。そのためには、動物の識別番号、耳のノッチパターン、腫瘍の体積を、スプレッドシートプログラムの3つの別々の列にリストします。
データを最小から最大の腫瘍量に並べ替えます。4番目の列では、各動物にケージ番号を割り当てます。すべての動物がケージに割り当てられるまで、ヘビのようなパターンでケージを循環させます。
ケージが割り当てられると、データをケージ番号で並べ替えます。免疫コンジュゲートを150マイクロリットルのhuA33-TCO溶液をPBSで1%ウシ血清アルブミンで前処理した注射器に引き込み、これらの注射器を氷の上に保存する。放射性リガンドを注入するために、まず、150マイクロリットルの0.9%無菌生理食塩水で、放射線標識テトラジン-PEG7-DOTAの1.1モル等価性を含有し、huA33-TCO投与量に対して投与する。
キャリパーを使用して、長い腫瘍の最も長い側と長さに垂直な幅を測定します。時間の経過に応じ、体重増加や体重減少を追跡するためにバランス上の各マウスを計量します。最後に、高さが幅とほぼ等しいと仮定して、楕円体の体積の式を使用して体積を計算します。
ここに示されているのは、huA33-TCOおよびLutetium-177-DOTA-PEG7-テトラジンを用いたインビボプレターゲティングの生物分布であり、皮下SW12222ヒト大腸カナー腫瘍を有する無数性ヌードマウスにおける。すべての注射間隔は、腫瘍組織における高い活性濃度と、健康な器官における低活性濃度を生み出す。24時間の注射間隔は、注射後120時間で最も高い腫瘍摂取を提供する。
これらの知見に基づいて、その後の縦断療法研究のために24時間間隔が選択された。ここに示されているのが、平均腫瘍体積で時間の関数として描かれた皮下SW1222腫瘍を有する5群のマウスの縦方向療法研究と、時間の関数として初期体積に正規化された腫瘍体積である。対照群と比較して、実験コホートの応答に大きな違いがあります。
標的を絞った放射線免疫療法戦略の1つの成分のみを受け取るマウスの腫瘍は未チェックで増殖し続けたが、完全な事前標的放射線免疫療法レジメンを受けているマウスの腫瘍は成長を停止し、最終的に縮小した。重要なことに、毒性の副作用は認められず、すべての動物は最初の質量の20%以内に体重を維持した。驚くべきことに、実験的なコホートのマウスは、調査の終わりに生存の完全な記録を持っていました。
この手順を試みるとき、腫瘍を正確かつ再現的に測定することが最も重要である。放射能を扱う場合は、安全なプロトコルと施設を開発するために、機関の放射線安全担当者に相談してください。適切な安全管理を実施すれば、露出を制限し、汚染を回避できます。
プレターゲティングは、従来の放射線免疫療法よりもバックグラウンド臓器への放射線量が低くなります。このプロトコルを共有することで、他の人が患者治療のための新しいエキサイティングな進歩につながる独自のモデルやアイデアをテストできることを願っています。
