によりは、国立衛生研究所の両方の一般的な医学の国立研究所 (T32GM088129) と国立歯科・頭蓋顔面研究 (F31DE026682) からの財政支援を認めています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。このプロジェクトは、また NIH (P30 AI036211、P30 CA125123 S10 RR024574) とジョエル ・ m ・ Sederstrom の専門家の助力からの資金とフローサイトメトリーおよび薬の Baylor の大学で細胞選別の中心によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の薬の Baylor の大学によって承認されています。
1. 腫瘍の収穫と消化
注: 収穫に要する時間は 3 ~ 5 分/腫瘍と処理に必要な時間は ~ 1 + 2-3 min/腫瘍。
<ol><li>炭酸ガス吸入によるマウスを安楽死させるし、髪の汚染を防ぐために収穫前に各マウスをダウン 70% エタノールをスプレーします。マウス皮下腫瘍を削除し、腫瘍が任意の汚染組織(すなわち髪、肌、腹膜等)の無料手術。24 ウェル プレートでのウシ胎児血清 (FBS) なし基本 RPMI 1640 メディアの 1.8 mL の各腫瘍を配置します。大きな収穫の細胞を維持するために氷の寒さのプレートを維持します。 注: 不妊が必要なすべての腫瘍の解剖必要がありますバイオ セーフティ キャビネット (すなわちハサミ、鉗子、等)、生殖不能の外科ツールとして次のステップで実行します。0.5 - 1 cm 最長の直径が付いている腫瘍が最適とより大きいまたは小さい腫瘍試薬のスケーリングが必要になります。</li>
	<li>各ウェル内の3個セット 1 mm 以下に腫瘍をカットするのにはさみを使用します。</li>
	<li>コラゲナーゼを溶解することにより消化カクテル x 10 の準備で 10 mg/mL、コラゲナーゼ IV 2,500 U/mL と DNase 私 200 U/mL 基本 RPMI 1640 メディア (FBS) なしで私。 注: カクテルの消化日を前もって準備して格納できます-20 ° c;ただし、酵素は一度解散時間をかけて活動を失うので、長期の保管はお勧めしません。</li>
	<li>私、コラゲナーゼ IV、DNase コラゲナーゼを含む解離カクテル × 10 の 200 μ l 添加 1 mm の3個の各ウェルに。</li>
	<li>軌道プレート シェーカーを使用しての 60-100 rpm で軽く振りながら 37 ° C で 1 時間のダイジェスト サンプルを許可します。 注: 酵素消化中に 37 ° C までの温度の上昇は、免疫細胞の活性化を引き起こす可能性があります。</li>
	<li>1 時間後の各ウェルに 5 %fbs と 2 mM EDTA 添加 RPMI 1640 メディアの 1 つの mL を追加することによって反応を中和します。</li>
	<li>50 mL の遠心管の上に座っている 40 μ m セル ストレーナーに腫瘍消化、残りの腫瘍部分をピペットします。 注: は、ストレーナーに腫瘍消化を容易に転送する 1 mL ピペット チップの先端をカットします。</li>
	<li>こし器を通して腫瘍部分を機械的に細かく分けた 10 mL シリンジのプランジャーを使用します。定期的に 2 ml の補われた RPMI 1640 メディアのストレーナーを洗浄 (5% を含む FBS) セル ストレーナーが腫瘍のクリアされるまでを繰り返します。 注: メディア総数の約 4-10 mL は十分に腫瘍のストレーナーを洗浄するための十分なはずです。 注: は、細胞生存率を維持するためにすべてのサンプルのこのステップを完了するまで氷にサンプルを配置します。</li>
	<li>補足 RPMI 1640 メディアを使用して同じボリュームに各 50 mL 遠心管を調整します。 注: ボリュームの調整は、遠心力のバランスをとるため重要です。遠心分離機の損傷やけがこのステップをスキップ可能性があります。</li>
	<li>(5 分、805 × g、4 ° C) 細胞懸濁液を遠心分離、培養上清を破棄し、再補足 RPMI 1640 メディアの 2 mL で中断します。 注: セルの集計は次の再懸濁しますにくい遠心分離フォームがあります。続行する前にそれを破るため急速に 5 mL の血清ピペットとミックスを使用します。</li>
</ol>2. 免疫と腫瘍細胞分画の分離
注: この手順の所要時間は約 1 時間です。
<ol><li>密度勾配媒体の 3 mL を 15 mL 遠心管の下部に追加します。準備し、ラベルを各腫瘍に対する十分なチューブ。</li>
	<li>層の 2 つの層の混合を防ぐために管の側をゆっくりとピペッティングによる密度勾配媒体上に腫瘍細胞懸濁液 2 mL。</li>
	<li>慎重に遠心分離機で 805 x g は、20 ° C、ないブレーキで 20 分間スピン多層チューブを配置します。 注: 適切なバランスを確認し、遠心分離中にブレーキを使用しないことを非常に重要です。このプロセスを中断する層の混合になります、サンプルの完全回復が困難になります。</li>
	<li>(ゴマ) 層と転送ピペットを使用して新しい 15 mL チューブにトップ メディア層白血球浸潤腫瘍を慎重に転送します。すべての残りの密度勾配媒体を破棄し、補われた RPMI 1640 の 2 mL でチューブの下部に腫瘍ペレットを再懸濁します。 注: 遠心分離後がありますそれぞれに対応する下に上から 4 つの可視レイヤー: 腫瘍細胞ペレット密度勾配媒体、ティルズ メディア。図 2さまざまな層の例についてはを参照してください。</li>
	<li>両方のティルを遠心し、腫瘍のサンプル チューブ (5 分、805 × g、4 ° C) を分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>200 μ L のティル サンプルと補われた RPMI 1640 メディアの 2 mL で腫瘍ペレットを再懸濁します。生存率を維持するために氷の上を保ちます。</li>
</ol>3. めっきと染色
注: めっきに必要な時間は 30 s/腫瘍;表面の汚損のための所要時間は 1 時間です。細胞内染色に要する時間は 40 分です。フローサイトメトリー解析は 1 - を必要な時間 4 分/腫瘍。
<ol><li>準備し、各免疫染色パネル、セルの追加プレート用ラベル 96 ウェルの U 底プレートをカウントします。 注: 通常、3枚のプレートは、合計で用意をしています: リンパ球に焦点を当てたパネル プレート、骨髄性に焦点を当てたパネル プレート、セル数プレート。</li>
	<li>分注染色のそれぞれに単一細胞懸濁液パネル プレートとセットのボリューム カウント板に。 メモ: カウント板により正確なセル人口それぞれの染色パネルに追加されるセルの合計数を計算するため使用されます。96 ウェル プレート サンプリングおよび容積測定分析機能を備えたフローサイトは各サンプルの μ L あたりのセル数を提供し、したがって、各染め色のパネルに追加されるセルの数を計算できます。数板は 4 ° C、FACs バッファーで洗浄で一晩固定後次の日を得ることができる (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 %fbs)、FACs バッファーの設定ボリュームで再と。</li>
	<li>(5 min, 805 × g、4 ° C) を遠心分離し、任意の無料の FBS を削除する各リンス間清を破棄してサンプルあたりダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 200 μ L で 2 回細胞を洗ってください。</li>
	<li>Fc ブロックの 50 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルをミックスし、4 ° C で 20 分間インキュベートを追加します。</li>
	<li>2 倍の 50 μ L 濃縮細胞ターゲティング抗体と修正可能な生存汚れの混合物、マルチ チャンネル ピペットを使用してミックス、RT または 4 ° C で暗闇の中で 30 分間インキュベートを追加します。 注: 抗体の正確な染色条件は、製造元によって異なります。すべての染色希釈は、修正可能性色素の飽和を防ぐためにない追加の FBS の DPBS でなければなりません。この原稿で使用されている染色パネルの最適な希釈液のためのテーブルの材料/機器を参照してください。Fc ブロックに追加される染色容量 100 μ L の濃度を染色 × 最終的な 1 を提供するために 2 倍の濃度では、抗体と修正可能性染色液を用意しています。</li>
	<li>(5 分、805 × g、4 ° C) を遠心分離し、各リンス間培養上清を破棄して FACs バッファーで 2 回サンプルを洗います。</li>
	<li>1 x 固定/透過液 200 μ L で再懸濁します、光から保護 4 ° C で一晩インキュベートします。 注: 実験を一時停止できる一晩この時点: 光から保護 4 ° c のサンプルを保ちます。</li>
	<li>次の日は (5 分、805 × g、4 ° C) プレートを遠心し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>濯ぎ 1 回 x 透過バッファー、遠心分離機 (5 分、805 × g、4 ° C)、1 の 200 μ L で、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 x 透過バッファーの準備 1 x 集中細胞抗体染色パネルの 100 μ L を追加し、RT または 4 ° C (製造元から染色の推奨によって異なります) で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>1 x 透過とバッファー (5 分、805 × g、4 ° C) は、上澄みを廃棄したらすすぎとリンス FACs バッファーと 2 回目 (PBS 2 %fbs)。</li>
	<li>FACs バッファーの 300 μ L のサンプルを再懸濁します (PBS 2 %fbs)、流れの cytometry チューブにサンプルを転送およびフロー フローサイトメトリー分析を実施します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+hallmarks+of+cancer.">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li><li>Whiteside, T. 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Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-Cytometry:+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes.">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice.">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Casadevall, A., Fang, F. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Mass+Cytometry+(CyTOF)+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells.">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li><li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model.">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

時間は、多様で複雑な細胞成分と分子で構成されます。最近の証拠は、この環境の正確な特性評価が治療の成功または障害のよりよい理解を提供できる治療抵抗性のメカニズムを特定するを助けてもいいこと示唆しています。たとえば、エフェクター免疫反応を軽減することができ、免疫療法の効果を破棄する腫瘍様々 な免疫細胞 (すなわちMDSCs、T 細胞など) のレベルを上げま?...

抑制時間は、最近、癌の特徴として認識されているし、開発、進行固形腫瘍癌の保護に重要な役割を果たすだけでなく、免疫療法1感受性を緩和する知られています。時間は、多数の細胞サブセットと腫瘍の免疫学的状態に重要な洞察力を提供するすべての表現型で構成されます。これらの免疫のサブセットは、一緒に自然免疫と適応免疫応答2,3の大半を構成するリンパ球や骨髄由来の細胞にさらに層化できます。がん免疫療法の分野の最近の進歩は免疫療法戦略(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体の T 細胞等)に耐久性のある癌を誘発する可能性があることを示しています。リグレッションただし、固形腫瘍の癌4,5で比較的効果が残ります。多数のグループでは、時間治療成功6、7、遊ぶことができる、したがって、特に中心前臨床設定の新しい免疫療法を正確に評価する必要があるいる、重要なハードルを示されている、変調または8時間を克服する機能。
通常時間を特徴付ける現在の努力はどちらか顕微鏡を利用またはフローサイトメトリー抗体の免疫細胞サブセットと9,10代の機能を識別するための戦略を分類と共に。これらの 2 つの戦略顕微鏡により細胞サブセットの空間感謝されフローサイトメトリー高スループット、携帯電話の変更のより広範な定量化一意に異なる情報を提供します。今まで 7 つのパラメーターをサポートできる、スペクトル イメージング システムの最適化多重免疫組織染色の最近の改善にもかかわらず限定パネル サイズ広範なレベル プロファイリング免疫困難は、したがってこの手法はしばしば予約詳細解析に焦点を当てた。その結果、フローサイトメトリーはプロファイリング技術最も広く使われている免疫の一つであります。時間評価技術の広範な使用、にもかかわらず処理と染色に使用される方法は非常に変数です。多くの場合プロトコル利用酵素の分離腫瘍 (すなわちコラゲナーゼ、DNase、等) と単一細胞懸濁液を達成するために手動の解離メソッドの後に抗体染色と分析7。それぞれの方法の利点があるにもかかわらず多数のグループはこれらテクニック11まで誘導することができます大規模な変動を示しています。これにより、同じマウス腫瘍モデルを評価する際にも、腫瘍微小環境のプロファイリングのクロス研究比較が非常に困難になります。さらに、これらのメソッドは、腫瘍細胞を評価する限られた可能性を提供し、腫瘍免疫侵入、独立していないコンポーネント消化後両方のコンポーネントが点在するので。サンプル量は、マルチパネル染色とまれな免疫学的サブセットを特徴付けるように試みとが主要な問題の分析を制限 (すなわち、腫瘍特定の T 細胞)12。質量 cytometry など (CyTOF)、飛行時間によってフローサイトメトリー最新技術は、42 の独立したパラメーター13以上のパネル デザインをサポートいくつかのシステムと細胞サブセットの高次元の表現型解析を許可します。CyTOF 免疫プロファイリング技術の驚異的なパワー、にもかかわらず、それは費用、解析の専門知識、および機器へのアクセスのため限られています。さらに、CyTOF プロトコルの多くは、信号対雑音比の14を改善するために免疫のサブセットの浄化をお勧めします、したがって私たちの濃縮方法を使用できることを提案 CyTOF 分析データの品質を向上させるための上流。
本腫瘍微小環境消化と腫瘍免疫を組み込む方法は侵入分離解析について述べる。このメソッドの目的は、腫瘍免疫浸潤、腫瘍微小環境の広範な評価の腫瘍細胞の一部分の独立した高スループット プロファイルを許可することです。このメソッドを使用すると、さらに示す全腫瘍の分析の重要性と皮下腫瘍モデル発見された重要な免疫不.全体的にみて、このメソッドより正確かつ一貫して比較できますサンプル間腫瘍内免疫細胞サブセットの豊か、独立した腫瘍細胞と腫瘍の免疫分数のプロファイリングが可能になります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">6 to 12 week old male C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:113px;">Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Mice used in our tumor studies</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line</td>
			<td style="width:113px;">Acquired from collaborator&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PX1840</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Murine surgical tool kit</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:167px;">Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">24-well plate&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">T1024</td>
			<td style="width:167px;">Or any 24-well flat bottom plate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R0883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">234153</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:113px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">LS004189</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:113px;">BioExpress (supplier: Genemate)&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S-3200-LS</td>
			<td style="width:167px;">Or any orbital shaker.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Thermoregulating incubator</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-255-27</td>
			<td style="width:167px;">Or any other thermo-regulated incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:113px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">E177</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 mL Pipette and tips</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13-690-032</td>
			<td style="width:167px;">Or any other pipette and tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40 um Cell Strainers</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1062-P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">15 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 mL Luer-Lok Syringe without needles</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lymphoprep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:113px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7811</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Transfer Pipettes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">P7212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">96-well U-bottom plates</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D8573</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">00-5523-00</td>
			<td style="width:167px;">Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermoregulated Centrifuge</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">For 96-well cell volumetric counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:216px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)&#160;Clone 2.4G2&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">553141</td>
			<td style="width:167px;">Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34962</td>
			<td style="width:167px;">Fixable viability stain</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">47-0451-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-5961-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD8-&#945; Antibody (KT15), PE</td>
			<td style="width:113px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-53473&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0041-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">56-5321-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0114-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">48-4801-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-0112-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-5931-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46-9972-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711</td>
			<td style="width:113px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563755</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors

腫瘍免疫微小環境 (時間) は最近特に免疫療法のための固形腫瘍の治療反応の重要な仲介人として認識されています。免疫療法の臨床的進歩は、再現可能な方法で正確かつ完全に特徴付ける腫瘍とその関連付けられた免疫潜入の必要性を強調表示します。腫瘍の酵素消化とフローサイトメトリーによる解析により、多数の免疫細胞サブセットおよび表現型; の広範な評価しかし、分析の深さは多くの場合パネルのデザインと大きな腫瘍のサンプルを取得する必要があります興味のまれな免疫個体を観察する fluorophore 制限によって制限されます。したがって、分離・非免疫腫瘍コンポーネントから腫瘍免疫潜入を豊かに高スループットの効果的な方法を開発しました。記載されている腫瘍消化と遠心密度ベースの分離技術により、腫瘍と腫瘍の個別特性免疫潜入分数と細胞生存率を保持し、したがって、腫瘍の広範な評価を提供します免疫学的状態。このメソッドは、さらに一貫性のある全体の腫瘍免疫学的プロファイリング技術の必要性を示す固形腫瘍広範なの空間的免疫不均一を特徴付けるために使用されました。全体として、このメソッドは固体マウス皮下腫瘍の免疫学的特性に対する効果的かつ適応手法を提供します。よい腫瘍の免疫学的機能を特徴付けるためのこのツールの使用など、新しい免疫療法戦略の前臨床評価。

プロトコルで説明したように、非免疫腫瘍コンポーネントから分離までの大きな利点を示した。また、記載されているメソッドを使用して確立された固形腫瘍の重要な免疫学的不均一性を示す.
多くの腫瘍解離技術の大きな問題として、過酷な消化条件 (すなわち、上昇温度、不十分な栄養供給など) の結果と...

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Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

enrichment-characterization-tumor-immune-non-immune-microenvironments

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.5K ビュー.  Baylor College of Medicine. ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

がん研究

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified to secrete human Prostate Specific Antigen (PSA), and the procedure for the confirmation of tumor implantation. In brief, mice are anesthetized using injectable drugs and are made to lay in the dorsal position. Urine is vacated from the bladder and 50 &#181;L of poly-L-lysine (PLL) is slowly instilled at a rate of 10 &#181;L/20 s using a 24 G IV catheter. It is left in the bladder for 20 min by stoppering the catheter. The catheter is removed and PLL is vacated by gentle pressure on the bladder. This is followed by instillation of the murine bladder cancer cell line (1 x 105 cells/50 &#181;L) at a rate of 10 &#181;L/20 s. The catheter is stoppered to prevent premature evacuation. After 1 h, the mice are revived with a reversal drug, and the bladder is vacated. The slow instillation rate is important, as it reduces vesico-ureteral reflux, which can cause tumors to occur in the upper urinary tract and in the kidneys. The cell line should be well re-suspended to reduce clumping of cells, as this can lead to uneven tumor sizes after implantation.
This technique induces tumors with high efficiency. Tumor growth is monitored by urinary PSA secretion. PSA marker monitoring is more reliable than ultrasound or fluorescence imaging for the detection of the presence of tumors in the bladder. Tumors in mice generally reach a maximum size that negatively impacts health by about 3 - 4 weeks if left untreated. By monitoring tumor growth, it is possible to differentiate mice that were cured from those that were not successfully implanted with tumors. With only end-point analysis, the latter may be mistakenly assumed to have been cured by therapy.

This protocol describes the generation of murine orthotopic bladder tumors in female C57BL/6J mice and the monitoring of tumor growth.

マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental enrichment (EE) reduces tumorigenesis by activating the mouse immune system, or affects tumor bearing animal survival by stimulating the wound repair response, including improved microbiome diversity, in the tumor microenvironment. Provided here is a detailed procedure to assess the effects of environmental enrichment on the biodiversity of the microbiome in a mouse colon tumor model. Precautions regarding animal breeding and considerations for animal genotype and mouse colony integration are described, all of which ultimately affect microbial biodiversity. Heeding these precautions may allow more uniform microbiome transmission, and consequently will alleviate non-treatment dependent effects that can confound study findings. Further, in this procedure, microbiota changes are characterized using 16S rDNA sequencing of DNA isolated from stool collected from the distal colon following long-term environmental enrichment. Gut microbiota imbalance is associated with the pathogenesis of inflammatory bowel disease and colon cancer, but also of obesity and diabetes among others. Importantly, this protocol for EE and microbiome analysis can be utilized to study the role of microbiome pathogenesis across a variety of diseases where robust mouse models exist that can recapitulate human disease.

Environmental Enrichment (EE) is an animal housing environment that is used to reveal mechanisms that underlie the connections between lifestyle, stress, and disease. This protocol describes a procedure that uses a mouse model of colon tumorigenesis and EE to specifically define alterations in microbiota biodiversity that may impact animal mortality.

マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce multiple tissue and organ damage. Despite recent advances and therapeutic approaches, the overall morbidity has remained unsatisfactory especially in patients with underlying parenchymal abnormalities. In the context of aggressive cancer growth and metastasis, surgical I/R is suspected to be the promoter regulating tumor recurrence. This article aims to describe a clinically relevant murine model of liver I/R and colorectal liver metastasis. In doing so, we aim to assist other investigators in establishing and perfecting this model for their routine research practice to better understand the effects of liver I/R on promoting liver metastases.

We describe in detail a clinically relevant colorectal cancer liver metastases (CRLM) tumor model and the influence of liver ischemia reperfusion (I/R) in tumor growth and metastasis. This model can help to better understand the mechanisms underlying surgery-induced promotion of liver metastatic growth.

虚血多灌流損傷の設定における転移性肝腫瘍のマウスモデル

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

要約

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この動画の章

ザ

マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法

チップチューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタルポリメラーゼ連鎖反応分析

虚血多灌流損傷の設定における転移性肝腫瘍のマウスモデル

小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

要約

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マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

マウスの大腸腫瘍モデルにおける結腸マイクロバイ生物多様性環境エンリッチメントの効果を定義する方法

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

虚血多灌流損傷の設定における転移性肝腫瘍のマウスモデル

小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

チップチューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタルポリメラーゼ連鎖反応分析