シグナル伝達は、生物学的および製薬研究において最も重要なテーマの1つです。細胞内シグナル伝達パートナータンパク質にシグナルを伝達するには、膜タンパク質が必要です。このプロトコルは、構造決定を目指すシグナリング複合体の調製に体系的な洗剤スクリーニングを行うよう設計されています。
このプロトコルは、確立された生物学の研究室で一般的に利用可能な技術を使用し、現場の初心者によって簡単に行われます。膜タンパク質複合体の調製において最も重要なパラメータを見つけるためにこれらの方法を構成した。まず、HEK293 GNT I欠損細胞ペレット30グラムを室温に解凍し、ビーカーに移します。
プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むPBSバッファーの120ミリリットルを加え、Dounceホモジナイザーまたは電気ホモジナイザーを13,000 RPMで30秒間使用して均質化します。PBSバッファーで150ミリリットルに音量を調整します。均質化された細胞に10%DDMを静かに加え、1時間氷上で1.25%撹拌の最終濃度を与えます。
可溶化後、細胞溶解物を摂氏4度で遠心分離し、Gを45分間150,000回Gに分解し、可溶化していない破片を除去する。上清を500ミリリットルのボトルに移し、50%1D4免疫親和性アガロース樹脂の10ミリリットルを加えます。可溶化した細胞溶解物と樹脂を摂氏4度で4時間または一晩穏やかに混合し、タンパク質結合を可能にします。
溶出樹脂混合物を開いたカラムに積み込んで樹脂を回収します。洗浄バッファーAの10カラム量で樹脂を洗浄し、タンパク質汚染物質を除去します。バルブを閉じ、バッファAの2つの列のボリュームで樹脂を再中断します。次に、薄暗い赤色光条件下で、再懸濁樹脂に9-シスレチナルを加えて、50マイクロモルの最終濃度にします。
暗い部分で4~16時間、摂氏4度で軽く混ぜて、レチナルバインディングを行います。その後、値を開き、列からバッファーを削除します。20カラム量のバッファーAを使用して樹脂を洗浄し、続いてバッファBの15カラム量を使用して、非結合のRetinalを除去します。
バッファーBの2列体積で樹脂を再懸濁し、その後、樹脂懸濁液を10 10ミリリットルの廃棄カラムに均等に分割します。10列からバッファーを取り出し、洗剤交換のために1ミリリットルのバッファーCで樹脂を再懸濁します。氷の上で1時間インキュベートします。
洗浄とインキュベーションをバッファーCでもう一度繰り返す。列からバッファーを取り出し、各列の溶出バッファーの 0.8 ミリリットルで樹脂を再懸濁します。2時間やさしく混ぜます。
チューブに各列からの溶出を収集します。各カラムの溶出バッファーの0.7ミリリットルで樹脂を再懸濁します。1時間やさしく混ぜます。
各カラムから溶出を同じチューブに集めます。暗闇の中で、排除されたタンパク質をクォーツキュベットにロードします。タンパク質サンプルのスペクトルを測定します。
495ナノメートルのロングパスフィルターの光通過で2分間キュベットでタンパク質を直接照らします。照らされたサンプルのスペクトルを測定します。他の9つの洗剤で精製されたすべてのタンパク質サンプルに対して同じ測定を行います。
暗い状態と照らされた状態の両方。通常の光の下で、各洗剤の状態のために1ミリリットル当たり0.7ミリグラムでロドプシンの100マイクロリットルを調製する。薄暗い赤色光の下で、1ミリリットル当たり0.7ミリグラムでロドプシンの混合物を100マイクロリットル、1ミリリットル当たり0.2ミリグラムでミニGOを調製します。
1ミリモル塩化マグネシウムで混合物を補います.495ナノメートルのロングパスフィルターからの光で混合物を照らし、30分間インキュベートします。サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、サンプルトレイに入れます。
各サンプルに対して77マイクロリットルのサンプルをロードし、1回の実行でSECバッファを25ミリリットル排除する浄化器を用いて、各サンプルに対して順次SEC実行を自動化する方法ファイルをプログラムする。280ナノメートルと380ナノメートルで吸光度を記録します。ロドプシンとロドプシンミニGO複合体のピーク画分を12.9ミリリットル前後の保持体積で収集します。
左ロドプシンサンプルとロドプシンミニGO複合体のピーク分率を、クマシーブルー染色で4~12%SDS変性勾配ゲルで分析します。1ミリリットルあたり1ミリグラムのロドプシンと1ミリリットル当たり0.01ミリグラムのPNGase Fの200マイクロリットルの混合物を調製する。よく混ぜて、一晩氷の上でインキュベートします。
1ミリリットル当たり1ミリグラムでロドプシンの200マイクロリットルの混合物を調製し、Endo F1-13は1ミリリットル当たり0.01ミリグラムで調製します。よく混ぜて、一晩氷の上でインキュベートします。SDS-ページとクマシーブルー染色による消化結果を分析します。
本研究では、小規模な精製のセットアップにより、さらなる分析に十分なタンパク質が得られた。ロドプシンの紫外線可視スペクトルは、青色曲線で9-シスレチ結合ロドプシンの暗い状態を示す。照射後、9-シス・レチナルは脱タンパク化され、異性体はすべてのトランスレチナルに入る。
280ナノメートルの吸収剤の比は、488ナノメートルの吸収剤と、380ナノメートルの吸収剤を超えて280ナノメートルの吸収剤の割合で、各洗剤で精製されたロドプシンの安定性を示しています。10種類の洗剤で精製されたロドプシンおよびロドプシン-ミニ-GO複合体のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルがここに示されている。標準マーカータンパク質のプロファイルは、DDMサンプルと共にオーバーレイとして示されます。
ピークプロファイルの解釈は、DDM、DM、Cymal-6、Cymal-5、およびOGNGに見られる理想的なシナリオを持つDMNGについて示されています。OGNGサンプルの拡大されたプロフィールは、ロドプシンとロドプシン-mini-GO複合体の両方が同じ保持量の周りに排除された示す。ロドプシン・ミニGO複合体のロドプシンおよびSEC精製サンプルのSDS-ページ分析をここに示す。
この図は、Endo F1およびPNGase F酵素によるロドプシン脱糖酵素のSDS-ページ分析を示す。個々の洗剤の影響をあいまいさなく明確に比較できるように、体系的な方法で洗剤スクリーニングを行うことが重要です。様々な量のタンパク質に対して、熱シフトアッセイは、タンパク質安定性に対する洗剤の影響を調べるためにも使用できます。
この方法により、安定したタンパク質複合体を調製し、最終的にジオアセンブリで失われた結晶構造を解明することができます。GPCR-Gタンパク質相互作用特異性に関する重要な洞察を提供した。
