Sinyal iletimi biyolojik ve farmasötik araştırmalarda en önemli konulardan biridir. Hücre içi sinyal partneri proteinlerine sinyal iletmek için membran proteinlerine ihtiyaç vardır. Bu protokol, yapı tayini amaçlayan bir sinyal kompleksi hazırlanmasında sistematik bir deterjan taraması yapmak üzere tasarlanmıştır.
Bu protokol, iyi kurulmuş bir biyoloji laboratuvarında yaygın olarak kullanılan teknikleri kullanır ve bu alanda yeni başlayanlar tarafından kolayca gerçekleştirilir. Membran protein kompleksinin hazırlanmasında en kritik parametreyi bulmak için bu yöntemleri oluşturduk. Başlamak için, oda sıcaklığına 30 gram HEK293 GNT I-eksik hücre pelet çözülüp bir kabına aktarın.
120 mililitre PBS tampon proteaz inhibitörü kokteyl ve homojen içeren bir Dounce homogenizer veya elektrikli homogenizer kullanarak ekleyin 13, 000 RPM 30 saniye. PBS arabelleği ile ses seviyesini 150 mililitreye ayarlayın. Homojenize hücrelere %10 DDM ekleyerek bir saat boyunca buzüzerinde %1,25'lik son konsantrasyonu karıştırın.
Solubilizasyondan sonra, hücre lisatını 45 dakika boyunca 45 dakika boyunca 45 derece ve 150,000 kez G'de santrifüj edin. 500 mililitrelik bir şişe supernatant aktarın ve 50%1D4 immünamunomu agarose reçine 10 mililitre ekleyin. Protein bağlanmasını sağlamak için çözünür hücre lisatını ve reçinesini dört saat veya gece boyunca dört derece santigrat derecede hafifçe karıştırın.
Reçine toplamak için açık bir sütuna lysate reçine karışımı yükleyin. Protein kirleticisini çıkarmak için reçineyi 10 sütun luk yıkama tamponu A ile yıkayın. Vanayı kapatın ve loş kırmızı ışık koşulualtında iki kolon hacimli tampon A.Next ile reçineyi yeniden askıya alın, renizme reçineye 50 mikromos son konsantrasyonuna 9 cis Retinal ekleyin.
Retina bağlama için karanlıkta 4 ila 16 saat boyunca dört santigrat derecede hafifçe karıştırın. Bundan sonra, değeri açın ve arabelleği sütundan kaldırın. Reçineyi 20 sütun hacmi arabellek A ile yıkayın ve ardından 15 sütun hacmi olan b sütunları bağlanmamış Retinal'i kaldırmak için b sütunlarını temizler.
Reçineyi iki sütun luk arabellek B'de yeniden askıya alın ve reçine süspansiyonuna eşit olarak 10 10 mililitrelik imha sütununa bölün. Arabelleği 10 sütundan çıkarın ve deterjan değişimi için her biri bir mililitre arabellek C'de reçine resin'i yeniden askıya alın. Buzda bir saat kuluçkaya yat.
C tamponunda yıkama ve kuluçkayı bir kez daha tekrarlayın. Arabelleği sütunlardan kaldırın ve her sütun için 0,8 mililitre elüsyon arabelleği içinde reçineyi yeniden askıya alın. Yavaşça iki saat karıştırın.
Bir tüp içine her sütundan elution toplamak. Her sütun için 0,7 mililitre elüsyon arabelleği reçinesini yeniden askıya alın. Yavaşça bir saat karıştırın.
Aynı tüpler halinde her sütundan elution toplamak. Karanlıkta, kuvars cuvette kaçan protein yükleyin. Protein örneğinin spektrumu ölçün.
495 nanometre uzunluğundaki geçiş filtresinden geçen ışıkla proteini iki dakika boyunca doğrudan cuvette'de aydınlatın. Işıklı numunenin tayfını ölçün. Diğer dokuz deterjanda saflaştırılı tüm protein örnekleri için aynı ölçümü yapın.
Hem karanlık hem de Aydınlık devletler. Normal ışık altında, her deterjan durumu için mililitre başına 0,7 miligram rodopsin 100 mikrolitre hazırlayın. Loş kırmızı ışık altında, mililitre başına 0,7 miligram ve mililitre başına 0,2 miligram mini-GO rodopsin karışımı 100 mikrolitre hazırlayın.
Bir milimolar magnezyum klorür ile karışımı tamamlayın. Karışımı 495 nanometre uzunluğundaki bir geçiş filtresinden gelen ışıkla aydınlatın ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Örnekleri otomatik numune şişelerine aktarın ve örnek tepsiye yerleştirin.
Sıralı SEC çalışır otomatikleştirmek için bir yöntem dosyası program otomatik örnekleyici sütuna örnek 77 mikrolitre yükleme ve temizleyici her çalıştırın başına SEC tampon 25 mililitre kaçan. Emiciliği 280 nanometre ve 380 nanometre olarak kaydedin. 12.9 mililitre civarında tutma hacminde rodopsin ve rodopsin-mini-GO kompleksinin tepe fraksiyonlarını toplayın.
Coomassie mavi boyama ile 4 ila% 12 SDS denaturing gradyan jeller üzerinde sol rodopsin örnekleri ve rodopsin-mini-GO kompleksinin pik fraksiyonları analiz edin. Mililitre başına bir miligramda 200 mikrolitre rodopsin ve mililitre başına 0,01 miligram pNGase F karışımı hazırlayın. İyi bir şekilde karıştırın ve bir gecede buzda kuluçkaya yatırın.
Mililitre başına bir miligram ve Endo F1-13 mililitre başına 0,01 miligram rodopsin 200 mikrolitre karışımı hazırlayın. İyi bir şekilde karıştırın ve bir gecede buzda kuluçkaya yatırın. SDS-Page ve Coomassie mavi boyama ile sindirim sonucu analiz edin.
Bu çalışmada, küçük ölçekli arınma kurulumu daha fazla analiz için yeterli protein vermiştir. Rodopsinin ultraviyole görünür spektrumları mavi kıvrımlarda koyu hal 9-cis Retinal bağlı rodopsin gösterir. Aydınlatmadan sonra, 9-cis Retinal deproteinated ve tüm trans-Retinal içine isomerizes.
Emicilerin 280 nanometre üzerindeki emicioranları 488 nanometre ve emiciler üzerinde 280 nanometre üzerinde emiciler üzerinde 380 nanometre de emiciler her deterjan da arıtılmış rodopsin kararlılığını tasvir. Burada 10 farklı deterjanda arıtılmış rodopsin ve rodopsin-mini-GO kompleksinin boyut dışlama kromatografi profilleri gösterilmiştir. Standart marker proteinlerin profili DDM örneği ile birlikte bindirme olarak gösterilir.
DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 ve OGNG için görülen ideal senaryo ile tepe profillerinin yorumlanması DMNG için gösterilmiştir. OGNG örneğinin büyütülmüş profili hem rodopsin hem de rodopsin-mini-GO kompleksinin aynı tutma hacmi etrafında nanınır olduğunu göstermektedir. Rodopsin ve SEC arınmış rodopsin-mini-GO kompleksi örneklerinin SDS-Sayfa analizi burada gösterilmiştir.
Bu rakam, Endo F1 ve PNGase F enzimleri ile rodopsin deglikozilasyonunun SDS-Sayfa analizini göstermektedir. Her bir deterjanın etkisinin belirsizlik olmadan açıkça karşılanabilmesi için deterjan taramasının sistematik bir şekilde yapılması çok önemlidir. Çeşitli miktarda protein için, termal kayma tsay da protein stabilitesi üzerinde deterjan etkisini incelemek için kullanılabilir.
Bu yöntem sayesinde, kararlı protein kompleksi hazırlamak ve sonunda jeo-montaj kayıp kristal yapısını çözmek edebiliyoruz. GPCR-G protein etkileşiminin özgüllüğü hakkında önemli bilgiler sağladı.
