La transducción de señales es uno de los temas más importantes en la investigación biológica y farmacéutica. Requiere proteínas de membrana para transmitir señales a su proteína asociada de señalización intracelular. Este protocolo está diseñado para realizar un cribado sistemático de detergentes en la preparación de un complejo de señalización destinado a la determinación de la estructura.
Este protocolo utiliza técnicas comúnmente disponibles en un laboratorio de biología bien establecido y es fácilmente realizado por los principiantes en el campo. Hemos compuesto estos métodos para encontrar el parámetro más crítico en la preparación del complejo de proteínas de membrana. Para empezar, descongelar 30 gramos de hek293 GNT I-deficiente pellet de células a temperatura ambiente y transferirlo a un vaso de precipitados.
Añadir 120 mililitros de tampón PBS que contengan cóctel inhibidor de la proteasa y homogéneo utilizando un homogeneizador Dounce o un homogeneizador eléctrico a 13.000 RPM durante 30 segundos. Ajuste el volumen a 150 mililitros con búfer PBS. Agregue suavemente 10%DDM a las células homogeneizadas para dar una concentración final de 1.25%Stir sobre hielo durante una hora.
Después de la solubilización, centrifugar el llaero celular a cuatro grados Celsius y 150.000 veces G durante 45 minutos para eliminar los escombros noolubilizados. Transfiera el sobrenadante a una botella de 500 mililitros y añada 10 mililitros de la resina de agarosa de inmunoafinidad 50%1D4. Mezclar suavemente el lesato celular solubilizado y la resina durante cuatro horas o durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir la unión a proteínas.
Cargue la mezcla de resina de izado en una columna abierta para recoger la resina. Lave la resina con volúmenes de 10 columnas de tampón de lavado A para eliminar el contaminante proteico. Cierre la válvula y resupend la resina con dos volúmenes de columna de tampón A.Next, en condiciones de luz roja tenue, agregue 9-cis Retinal a la resina resuspendida a una concentración final de 50 micromolares.
Mezcle suavemente a cuatro grados centígrados durante cuatro a 16 horas en la oscuridad para la unión de retina. Después de eso, abra el valor y quite el búfer de la columna. Lave la resina con volúmenes de 20 columnas de búfer A, seguidos de 15 volúmenes de columna de búfer B para eliminar Retinal sin enlazar.
Resuspender la resina en dos volúmenes de columna de tampón B y luego dividir la suspensión de resina por igual a 10 columnas de eliminación de mililitros. Retire el tampón de las 10 columnas y luego resusppend la resina cada una en un mililitro de tampón C para el cambio de detergente. Incubar durante una hora en hielo.
Repita el lavado y la incubación en el tampón C una vez más. Retire el búfer de las columnas y, a continuación, resusppend la resina en 0,8 mililitros de búfer de elución para cada columna. Mezcle suavemente durante dos horas.
Recoger la elución de cada columna en un tubo. Resuspender la resina en 0,7 mililitros de búfer de elución para cada columna. Mezcle suavemente durante una hora.
Recoger la elución de cada columna en los mismos tubos. En la oscuridad, cargue la proteína eludida en la cubeta de cuarzo. Mida el espectro de la muestra de proteína.
Ilumina la proteína directamente en la cubeta durante dos minutos con el paso ligero del filtro de paso largo de 495 nanómetros. Mida el espectro de la muestra iluminada. Realice la misma medición para todas las muestras de proteínas purificadas en los otros nueve detergentes.
Estados oscuros e iluminados. Bajo la luz normal, para cada condición de detergente preparar 100 microlitros de rodopsina a 0,7 miligramos por mililitro. Bajo luz roja tenue, prepara 100 microlitros de mezcla de rodopsina a 0,7 miligramos por mililitro y mini-GO a 0,2 miligramos por mililitro.
Suplementar la mezcla con un cloruro de magnesio milimiolar. Ilumina la mezcla con luz de un filtro de paso de 495 nanómetros de largo e incuba durante 30 minutos. Transfiera las muestras a los viales de muestreador automático y colóquelas en la bandeja de muestras.
Programe un archivo de método para automatizar las ejecuciones sec secuenciales para cada muestra con el muestreador automático cargando 77 microlitros de la muestra en la columna y el purificador eludiendo 25 mililitros de búfer SEC por ejecución. Registre la absorbancia en 280 nanómetros y 380 nanómetros. Recoger las fracciones máximas de rhodopsin y rhodopsin-mini-GO complejo en el volumen de retención alrededor de 12,9 mililitros.
Analice las muestras de rodopsina izquierda y las fracciones máximas del complejo rodopsino-mini-GO en geles de gradiente de desnaturalamiento de cuatro a 12%SDS con tinción azul de Coomassie. Preparar una mezcla de 200 microlitros de rodopsina a un miligramo por mililitro y PNGase F a 0,01 miligramos por mililitro. Mezclar bien e incubar sobre hielo durante la noche.
Preparar una mezcla de 200 microlitros de rodopsina a un miligramo por mililitro y Endo F1-13 a 0,01 miligramos por mililitro. Mezclar bien e incubar sobre hielo durante la noche. Analizar el resultado de la digestión mediante sdS-Page y Coomassie mancha azul.
En este estudio, la configuración de purificación a pequeña escala produjo suficiente proteína para análisis posteriores. Los espectros visibles ultravioletas de rodopsin muestran el estado oscuro 9-cis Retinal bound rhodopsin en curvas azules. Después de la iluminación, 9-cis Retinal se desproteina e isomeriza en todo trans-Retinal.
Las proporciones de absorbentes a 280 nanómetros sobre absorbentes 488 nanómetros y absorbentes a 280 nanómetros sobre absorbentes a 380 nanómetros representan la estabilidad de la rodopsicina purificada en cada detergente. Aquí se muestran perfiles cromatográficos de exclusión de tamaño de rodopsin y complejo rodopsino-mini-GO purificados en 10 detergentes diferentes. El perfil de las proteínas de marcador estándar se muestra como superposición junto con la muestra DDM.
La interpretación de los perfiles máximos se muestra para DMNG con el escenario ideal visto para DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5, y OGNG. El perfil magnificado de la muestra OGNG muestra tanto rhodopsin como rhodopsin-mini-GO complejo eludido alrededor del mismo volumen de retención. El análisis SDS-Page de rhodopsin y la SEC purificado muestras de rhodopsin-mini-GO complejo se muestra aquí.
Esta figura muestra el análisis SDS-Page de deglycosilación rodopsina con enzimas Endo F1 y PNGase F. Es fundamental realizar el cribado de detergente de forma sistemática, de modo que el impacto de cada detergente individual se pueda comparar claramente sin ambiguedades. Para proteínas de varias cantidades, el ensayo de cambio térmico también se puede utilizar para estudiar el impacto del detergente en la estabilidad de las proteínas.
Gracias a este método, somos capaces de preparar un complejo proteico estable y eventualmente resolver la estructura cristalina perdida en el geoensa. Proporcionó información importante sobre la especificidad de la interacción con proteínas GPCR-G.
