Трансдукция сигналов является одной из наиболее важных тем в биологических и фармацевтических исследованиях. Он требует мембранных белков для передачи сигналов к их внутриклеточной сигнализации белка партнера. Данный протокол предназначен для проведения систематического скрининга моющих средств при подготовке сигнального комплекса, направленного на определение структуры.
Этот протокол использует общедоступные методы в хорошо созданной биологической лаборатории и легко выполняется новичками в этой области. Мы составили эти методы, чтобы найти наиболее важный параметр в подготовке мембранного белкового комплекса. Для начала оттайте 30 граммов HEK293 GNT I-дефицитных клеточных гранул до комнатной температуры и перенесите его в стакан.
Добавьте 120 миллилитров буфера PBS, содержащего ингибитор протеазы и однородного с помощью однородного Dounce или электрического гомогенизатора при 13 000 об/мин в течение 30 секунд. Отрегулируйте громкость до 150 миллилитров с буфером PBS. Аккуратно добавьте 10%DDM к гомогенизированным клеткам, чтобы дать окончательную концентрацию 1.25%Перемешать на льду в течение одного часа.
После solubilization, центрифуга клетки лизолировать при четырех градусах по Цельсию и 150000 раз G в течение 45 минут, чтобы удалить несоленый мусор. Перенесите супернатант в бутылку с 500 миллилитров и добавьте 10 миллилитров смолы агарозы 50%1D4. Аккуратно смешайте солубилизованный лизат клеток и смолу в течение четырех часов или на ночь при четырех градусах Цельсия, чтобы обеспечить связывание белка.
Загрузите лисатную смесь смолы в открытую колонку для сбора смолы. Вымойте смолу с 10 объемами колонки буфера мытья, чтобы удалить загрязняющий белок. Закройте клапан и повторно посовестить смолу двумя объемами колонки буфера A.Next, при тусклом состоянии красного света, добавьте 9-cis Retinal к повторной смоле к окончательной концентрации 50 микромолей.
Аккуратно смешайте при четырех градусах по Цельсию в течение четырех-16 часов в темноте для связывания сетчатки. После этого откройте значение и удалите буфер из столбца. Вымойте смолу 20 объемами столбца буфера А, а затем 15 объемами столбца буфера B для удаления несыхвачилой сетчатки.
Переусердуем смолу в двух объемах колонки буфера B, а затем разделить подвеску смолы поровну до 10 10 миллилитров удаления столбцов. Удалите буфер из 10 столбцов, а затем повторно помесить смолы каждый в один миллилитр буфера C для изменения моющего средства. Инкубировать в течение одного часа на льду.
Повторите стирку и инкубацию в буфере C еще раз. Удалите буфер из столбцов, а затем повторно поместить смолу в 0,8 миллилитров буфера элюции для каждого столбца. Аккуратно перемешайте в течение двух часов.
Соберите элюцию из каждой колонки в трубку. Переусердуем смолу в 0,7 миллилитров буфера элюции для каждого столбца. Аккуратно перемешайте в течение одного часа.
Соберите элюцию из каждой колонки в одно и те же трубки. В темноте загрузите ускользаемый белок в кварцевый кюветт. Измерьте спектр образца белка.
Осветите белок непосредственно в кюветте в течение двух минут со светом пройти через 495 нанометров длинный проход фильтра. Измерьте спектр освещенного образца. Выполните то же измерение для всех образцов белка, очищенных в остальных девяти моющих средствах.
И темные, и освещенные состояния. При нормальном освещении для каждого моющего средства готовят 100 микролитров родопцина по 0,7 миллиграмма на миллилитр. При тусклом красном свете приготовьте 100 микролитров смеси родопцина по 0,7 миллиграмма на миллилитр и мини-GO по 0,2 миллиграмма на миллилитр.
Дополните смесь одним миллимолярдом хлорида магния. Осветите смесь светом от 495 нанометрового фильтра и инкубировать в течение 30 минут. Перенесите образцы в автоотборочных флаконов и поместите их в лоток образца.
Программа файл метода для автоматизации последовательных SEC работает для каждого образца с авто-сэмплер загрузки 77 микролитров образца в столбец и очиститель ускользает от 25 миллилитров буфера SEC за запуск. Замечете абсорбт на 280 нанометров и 380 нанометров. Соберите пиковые фракции родопсинов и родопсин-мини-ГО комплекса при объеме удержания около 12,9 миллилитров.
Проанализируйте левые образцы родопсинов и пиковые фракции комплекса родопсин-мини-GO на четырех-12%SDS денатурации градиентных гелей с синим окрашиванием Кумасси. Подготовка 200 микролитров смесь родопсин на один миллиграмм на миллилитр и PNGase F на 0,01 миллиграмма на миллилитр. Хорошо перемешать и инкубировать на льду на ночь.
Приготовьте 200 микролитровую смесь родопцина по 1 миллиграмму на миллилитр и Эндо F1-13 по 0,01 миллиграмма на миллилитр. Хорошо перемешать и инкубировать на льду на ночь. Проанализируйте результат пищеварения с помощью SDS-Page и голубого окрашивания Кумасси.
В этом исследовании, небольшие установки очистки масштаба дали достаточно белка для дальнейшего анализа. Ультрафиолетовые видимые спектры родопсин показывают темное состояние 9-cis сетчатки связаны родопсин в синих кривых. После освещения 9-cis Retinal депротеинируется и изомеризируется во все транс-retinal.
Коэффициенты абсорбентов на 280 нанометров над абсорбентами 488 нанометров и абсорбентов на 280 нанометров над абсорбентами на 380 нанометров изображают стабильность родопсин очищены в каждом моющее средство. Здесь показаны профили хроматографии родопцина и родопсин-мини-GO, очищенные в 10 различных моющих средствах. Профиль стандартных белков маркера отображается как наложение вместе с образцом DDM.
Интерпретация пиковых профилей показана для DMNG с идеальным сценарием для DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 и OGNG. Увеличенный профиль образца OGNG показывает, что как родопсин, так и родопсин-мини-GO-комплекс ускользали от одного и того же объема удержания. Здесь показан анализ родопсинов и SEC, очищенных от родопсин-мини-GO комплекса SDS-Page.
На этом рисунке показан анализ дезгликосалирования родопцина с ферментами Endo F1 и PNGase F. Крайне важно проводить скрининг моющих средств на систематической основе, с тем чтобы можно было четко сравнить воздействие каждого отдельного моющего средства без двусмысленности. Для белка различного количества, тепловой сдвиг анализ также может быть использован для изучения влияния моющего средства на стабильность белка.
Благодаря этому методу мы можем подготовить стабильный белковый комплекс и в конечном итоге решить кристаллическую структуру, потерянную в гео-сборке. Это дало важное представление о специфичности взаимодействия белка GPCR-G.
