このプロトコルは、複数のPTMを抗体を用いて同時に濃縮し、続いてデータ独立取得質量分析を行い、サイトの局在化およびクロストークに関する生物学的洞察を得るための新しい技術を説明する。これは、少量のサンプル入力のみを含むアセチル化およびスクシニル化PTMを含むスライシングを用いたペプチドの同時同定と定量を可能にする、時間と費用対効果の高い技術です。翻訳後の変更を追跡することは、さまざまな疾患状態を特徴付け、対処する上で重要なステップです。
私たちはすでに、特定の癌や糖尿病がこれらのタンパク質改変を通じて高度に規制されていることを認識しています。この方法は、ユビキチン化、リン酸化などの濃縮のための抗体を持つ任意のPTMに理論的に適用することができます。また、他の組織タイプまたは細胞培養モデルにも適用できます。
この技術を用いて価値あるデータを得る鍵は再現性です。これは、すべてのステップが非常に慎重に行われることを確認することによって達成することができます特に、抗体ビーズを含むステップ。まず、最大10ミリグラムのタンパク質を組み合わせたC18樹脂を含むカートリッジを入手してください。
これらのカートリッジを真空装置に取り付けます。80%のアセトニトリルの800マイクロリットルと0.2%のギ酸を19.8%の水でカートリッジに加え、真空吸引を開始して液体を引き抜きます。カートリッジの乾燥を完全に避けてこのステップを1回繰り返します。
真空吸引で水に0.2%のギ酸の800マイクロリットルを加えることによってカートリッジを平衡化します。これを 2 回繰り返します。真空吸引で約1,000マイクロリットル溶液に1ミリグラムのペプチドをカートリッジにロードします。
真空吸引下水中の水中で0.2%のギ酸の800マイクロリットルでペプチドを2回洗浄してください。次に、各カートリッジの下に1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管を配置してペプチドを収集します。真空吸引の下で、最初に800マイクロリットルの800マイクロリットルのアセトニトリルと0.2%のギ酸を19.8%水でカートリッジから溶出し、同じ溶液の400マイクロリットルで溶出した。
脱塩したペプチドサンプルを真空濃縮器で2~3時間完全に乾燥させます。さて、乾燥したペプチドを1.4ミリリットルの冷たい1X免疫親和性精製バッファーに再懸濁させる。約7のpHを混合し、確保する渦。
摂氏4度で10分間10,000倍gのサンプルを遠心分離します。小さなペレットが表示されます。抗体ビーズを調製しながら、氷の上にペプチドを脇に置きます。
100マイクロリットルのK-アセチル抗体ビーズスラリーと100マイクロリットルのK-スクシニル抗体ビーズスラリーを含むチューブを含むチューブに冷たい1X PBSの1ミリリットルを加え、ピペット処理して混合します。ソリューション全体を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、ミニチュア遠心分離機で室温で30秒間回転させます。任意のビーズを吸引しないように注意を払ってPBSを吸引します。
さらに3回洗い流します。次に、約440マイクロリットルのPBSでビーズを再懸濁する。よく混ぜるためにビーズを数回ピペット。
200マイクロリットルのプレカットチップを使用して、各アセチルリジン抗体ビーズとサクシニル化抗体ビーズの100マイクロリットルを新しいチューブに移します。ミニチュア遠心分離機で30秒間スピンダウンし、ゲルローダーチップでメディアを吸引します。ビーズが白くなるようになりました。
再懸濁されたペプチドを洗浄されたビーズに直接ピペットし、一晩でビーズを4°Cで攪拌してインキュベートする。朝、ペプチドサンプルを2,000倍gで30秒間摂氏4度で回転させます。非結合ペプチドを含む上清を除去し、必要に応じて、将来の実験のために保存します。
冷たい1X免疫親和性精製バッファーをビーズに1ミリリットル加え、5回反転して洗浄し混合します。摂氏4度で30秒間2,000倍gで回転します。免疫親和性精製液を吸引し、免疫親和性精製洗浄工程をもう一度繰り返す。
その後、冷たいHPLC水を1ミリリットルビーズに加え、5回反転して混ぜます。摂氏4度で30秒間2,000倍gで回転します。水を吸い取り、さらに2回水洗いステップを繰り返します。
2,000回gで30秒間摂氏4度で回転し、チューブ底に残った水を集めます。平らな先端のゲルの負荷の先端によって、集めた余分な水を吸引する。ビーズを吸引しないように注意してください。
55マイクロリットルの0.15%トリフルオロ酢酸をビーズに水に加えます。時折混合するチューブの底をタップしながら、室温で10分間ビーズをインキュベートします。ミニチュア遠心分離機で30秒間、室温でビーズを回転させます。
平らな先端のゲルローディングの先端を使用して、溶出したペプチドを新しいチューブに移します。45マイクロリットルの0.15%トリフルオロ酢酸をビーズに水に加えます。チューブの底部をたたたきながら室温で10分間インキュベートして混合する。
ミニチュア遠心分離機で30秒間、室温でビーズを回転させます。平らな先端のゲルの負荷の先端を使用して第二の溶出を取り除き、最初の溶出とそれを結合する。結合した溶出ペプチドを12,000倍gで室温で5分間回転させ、持ち越すビーズをペレットします。
ペプチドサンプル溶液を新しい500マイクロリットルチューブに移します。濃縮ペプチド混合物をC18プレカラムチップにロードし、1分間に2マイクロリットルの移動相Aで洗浄して再びペプチドを脱塩するローディング方法を構築します。ペプチドが分析カラムに移され、移動相AおよびB.具体的に使用して2〜3時間の勾配で毎分300ナノリットルの流量で溶出するようにクロマトグラフィー法を構築し、5%移動相Bから35%移動相Bまでの線形勾配を80分間にわたって使用する。
その後、移動相Bを5分間で80%に引き上げ、8分間80%Bで保持してから5%Bに戻り、25分間の再平衡化を行います。次に、データ依存の取得のための MS 計測器メソッドを構築します。実験1では、M/Z 400から1,500までのMS1前駆体イオンスキャンを設定します。
期間を 120 分に設定します。IDA 実験を作成し、「OK」をクリックします。スイッチ基準タブで、毎秒2~5~200カウントの間の帯電状態のイオンのMS/MSスキャンをトリガする強度しきい値を設定します。前駆体イオンの動的除外を60秒に設定します。
実験 2 の場合は、MS2 スキャンの範囲を M/Z 100 から 1,500 の範囲で MS/MS 製品のイオン スキャンに設定します。パラメータを編集して衝突エネルギーの拡散を 5 に設定し、高感度製品イオンスキャン モードを選択します。最後に、サンプルをオートサンプラーに入れ、
サンプルキューを提出し、データ非依存の取得のためのMS計測方法を構築し、2つの計測器スキャン実験を定義するLC-MS/MS取得方法を開始します。MS1前駆体イオンスキャンを400~1,250質量でスキャンして充電し、持続時間を120分に設定します。衝突エネルギーの拡散を10に設定し、蓄積時間を45ミリ秒に設定し、高感度製品イオンスキャンモードを選択します。
次に、64 の可変ウィンドウ DIA SWATH 取得スキームを含むテキスト ファイルをインポートして、SWATH 取得ウィンドウをメソッドに取り込みます。この取得スキームでは、5~90質量から充電、幅の範囲の可変窓が400~1,250質量の全質量範囲にわたって段階的に通過し、合計64のSWATHセグメントを合計で45ミリ秒の累積時間で充電します。MS1 の累積時間を 0.25 秒に調整します。
MS1 スキャンと 64 の MS2 スキャンを組み合わせて、合計サイクル時間 3.2 秒を生成する必要があります。本研究では、実験結果はPTMクロストークを検出し評価する可能性を文書化した。この表は、ワークフローのタイムラインと、必要なサンプルとタンパク質の量を示しています。
ワンポット法は、これらの代替方法と同じくらいの時間とサンプル数の半分で実行できます。改変ペプチド領域の変動の中央値係数は、単一PTMおよびシリアルPTM濃縮よりもワンポット法において低かった。1ポットPTMとシングルPTMの濃縮方法を比較する一方で、2つの変更に対するサイトレベルの定量の相関には注目すべき違いは見当たらない。
この図は、成功した濃縮からのデータを表示し、PTMクロストークを視覚化する複数の異なるアシル修飾を含むペプチドの例を示しています。ペプチドは、一方のリジン残基にアセチル化され、他方で簡潔にされ、ここで同じペプチドが両方のリジンで簡潔に行われた。これは、同じリジン残基が両方のアシル化基で修飾され、その部位でクロストークが起こる可能性があることを示している。
各サンプルに同じ量のビーズが含まれていることを確認し、ペプチド結合ビーズを洗浄する際に誤って吸引されないようにすることが不可欠です。Spectronautなどのソフトウェアツールでの質量分析ベースのプロファイリングとデータ分析は、PTMのサイトローカリゼーションを特定、定量化、実行するために、この手順に従って実行されます。このデータに依存しない取得ワークフローと同時 PTM エンリッチメントを組み合わせて、PTM のクロストークをより効率的に評価する手段を開き、PTM シグナリングの関連性に関するより良い洞察を提供します。
