2機能チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィー戦略は、同じワークフローでN-糖ペプチドとリンペプチドの両方を濃縮し、同じ分析から生体分子情報を増やすことができます。この濃縮の主な利点は、下流の質量分析分析のために別々の画分中のN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分離を可能にする2つの分離メカニズムです。この濃縮法を用いると、糖尿病や癌などの疾患バイオマーカー発見に向けて、膵臓組織などの複雑な生体試料におけるグリコシル化やリン酸化の検出を向上させることができます。
この方法はスピンチップと遠心分離に依存するため、遠心分離速度を制御し、目詰まりを防ぐためにサンプルに微粒子がないことを確認することが重要です。まず、膵臓組織と接触する組織粉砕機の部分、すなわちチャンバー、粉砕機、および回収スプーンを、ヘラとともにポリスチレン容器に予め冷やす。次に、組織片を予め冷却されたサンプルホルダーに移し、凍結されるまで組織に液体窒素を加える。
チャンバー内に粉砕機を入れた後、マレットを用いて5~10回叩いて試料を粉砕し、次いで粉砕機をチャンバーから取り出し、付着組織粉末及び片を掻き取る。次に、組織が溶け始めたらスプーン一杯の液体窒素をチャンバーに加え、微粉末が得られるまで粉砕プロセスを繰り返し、サンプルを約100ミリグラムのアリコートに予め冷却されたチューブに分割する。溶解緩衝液を調製した後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の各1錠を500マイクロリットルの水に溶解し、所望の最終濃度の20倍のストックに対して、各インヒビターの必要量のストックを溶解バッファーに添加して、最終インヒビター濃度を達成する。
チューブに600マイクロリットルの溶解バッファーを加えた後、加熱ブロック内で摂氏95度で800RPMで振とうしながら10分間インキュベートし、次いでサンプルを加熱ブロックから取り出して室温まで冷却する。次に、30秒の休息を挟んだ15秒パルスを使用して、60ワットのエネルギーでサンプルを45秒間超音波処理し、摂氏4度で15分間、3000倍のGでサンプルをペレット化します。上清を沈殿溶媒の5倍の体積に加える。
例えば、50%アセトン、49.9%エタノール、および0.1%酢酸を含む1.5ミリリットルの沈殿溶媒に300マイクロリットルの溶解緩衝液を、摂氏80度で一晩冷やす。試料を摂氏4度で15分間、3000倍Gで再度ペレット化し、上清を除去した後、ヘラで割ってペレットを洗浄し、同量の沈殿溶媒と混合する。遠心分離後、試料ペレットをヒュームフード内で15分間風乾し、進行の準備ができるまで摂氏80度で保存する。
まず、タンパク質ペレットを、50ミリモルのトリエチルアンモニウム重炭酸緩衝液および8モルの尿素を含む300マイクロリットルの新しく作られた消化緩衝液に再懸濁する。溶液中のタンパク質に、ジチオスレイトールを終濃度5ミリモルに添加し、混合し、室温で1時間減少させた後、ヨードアセトアミドを終濃度15ミリモルで添加する。混合し、暗所で室温で30分間アルキル化した。
次に、Lys-C/Trypsin を 1 ~ 100 の酵素対タンパク質比で加え、インキュベーター内で摂氏 37 度で 4 時間インキュベートした後、50 ミリモルのトリエチルアンモニウム重炭酸緩衝液を加えて、使用した 8 モルの尿素を 1 モル未満に希釈します。トリプシンを1〜100の酵素対タンパク質比で添加した後、インキュベーター内で摂氏37度で一晩インキュベートし、続いてトリフルオロ酢酸を添加して消化をクエンチする。開始タンパク質1ミリグラムごとに、1ミリリットルのアセトニトリルで脱塩カートリッジをコンディショニングし、1ミリリットルの0.1%トリフルオロ酢酸で3回状態にしてから、消化した混合物を脱塩カートリッジにロードし、1ミリリットルの0.1%トリフルオロ酢酸を使用して混合物を3回洗浄する。
次に、1ミリリットルの60%アセトニトリルおよび0.1%ギ酸溶液を用いてペプチドを溶出し、次いで、溶媒が完全に蒸発するまで遠心真空濃縮器を用いて約35°Cでペプチドを乾燥させた。ペプチドを水に再懸濁した後、製造業者のプロトコールに従ってペプチドアッセイを使用してペプチド濃度を推定し、次いでペプチドを500マイクログラムのアリコートに分割し、完全に乾燥させる。約3ミリグラムのコットンウールの重さを量り、空のスピンチップに詰めます。
チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィー材料1グラムをチューブに移した後、既知の濃度の材料に0.1%トリフルオロ酢酸を加える。スピンチップに20ミリグラムの材料を移すのに十分なスラリーを加えた後、200マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸で遠心分離してスピンチップを洗浄する。サンプルを200マイクロリットルの装填/洗浄溶媒に再懸濁し、スピンチップを流します。
ロード/洗浄溶媒で遠心分離によりスピンチップを洗浄した後、200マイクロリットルの80%アセトニトリル0.1ギ酸溶液でスピンチップを洗浄し、次いで200マイクロリットルのE1およびE2でペプチドを溶出し、各溶出を別々に分析する。E3 および E4 溶媒を使用して溶出プロセスを繰り返し、下流分析の前に適切な溶出画分を結合します。塩基性pHで溶出を行う前に、2.5%水酸化アンモニウム中に200マイクロリットルの90%アセトニトリルを使用して材料を3回条件付けし、次いで200マイクロリットルのE5およびE6溶媒でペプチドを溶出し、これらの溶出物を脱水した後、充填チップを使用して別々に分析する。
次に、200マイクロリットルの異なる濃度のアセトニトリルおよび水酸化アンモニウムでペプチドを溶出する。その後、これらの溶出液を合わせ、1つのサンプルとして分析し、E7、充填チップを用いて脱塩後。N-グリコシル化ペプチドおよびリン酸化ペプチドから注釈付きの高信頼性MS/MSスペクトルが得られ、前駆体の豊富な断片化により、データベース検索ソフトウェアによって割り当てられた同定の信頼性が向上しました。
ペプチド同定は、各溶出画分にわたって二機能チタン固定化金属アフィニティークロマトグラフィースピンチップ法を使用して濃縮されたサンプルから見出された。糖ペプチドの大部分は最初の4つのフラクションで溶出し、リンペプチドの大部分は最後の3つのフラクションで溶出するため、イオン化における潜在的な干渉が軽減されます。デュアルチタン法からのグリコプロテオミクスの結果をエールリッヒ - 糖ペプチドのみの濃縮と比較し、ビニング後の各タイプのグリカンの組成に基づいて6つのカテゴリーに分けた割合が、両方の方法間で類似していることを実証した。
デュアルチタン法からのホスホプロテオミクスの結果は、リンペプチドのみの富化または両方の方法を用いた従来の固定化金属アフィニティークロマトグラフィーと比較した。リン酸化アミノ酸の大部分は、セリンおよびスレオニンとして同定され、約1%のリン酸化チロシンが同定された。スピンチップを適切に構築することは、スムーズな溶出を確実にするために重要です。
コットンを先端にしっかりと差し込み、濃縮素材をコットンの上に詰め込むことができます。我々は、ほとんどの組織およびSARS-CoV-2スパイクタンパク質におけるグリコシル化およびリン酸化の同時特性評価に、二重機能チタンIMAC法を使用した。
