このプロトコルは、質量分析によるタンパク質アルギニンメチル化のグローバル分析のための最先端のワークフローを表すため、非常に重要です。これは、他の生化学的手法では達成できない単一のスタイル分解能でR-メチル化タンパク質を同定およびプロファイリングする唯一の方法です。PRMT阻害剤(そのうちのいくつかは臨床試験中および抗がん剤)の使用と組み合わせると、このプロトコルはそれらの作用機序の詳細な分析を可能にする。
まず、終濃度4.5ミリモルの超純水に溶解したDTTの原液を用いてタンパク質のチオール基の還元を行い、55°Cで30分間反応させます。ヨードアセトアミドを10ミリモルの濃度で添加し、暗所で室温で15分間インキュベートすることにより、タンパク質のチオール基のアルキル化を行う。タンパク質分解効率を検証するには、SDS-PAGEクーマシー染色ゲルでその後の分析のためにタンパク質抽出物のアリコートを保存し、消化時に対応する量のサンプルと比較します。
残りのタンパク質抽出物をpH 8.0で4容量の20ミリモルHEPESで希釈して、最終尿素濃度2モルに達します。サンプルを2つの部分に分割し、シーケンシンググレードの修飾トリプシンを一方に、LysargiNaseプロテアーゼをもう一方に追加します。酵素消化を可能にするために、サンプルを摂氏37度で600回転のサーモミキサーで一晩放置します。
クロマトグラフィーグラジエントごとに、すべての画分を深い96ウェルプレートに集めます。勾配の開始前に収集された分数を、preという名前の1つの分数にプールします。高pH逆相液体クロマトグラフィーグラジエントからの60個のフラクションを、連続していない方法で14個の最終フラクションにプールすることにより、連結します。
非連続連結を得るためには、テキスト原稿に記載されているように、高pH逆相画分をプールする。勾配の後に収集された分数を、postという名前の一意の分数にプールします。トリプシンおよびリサルギナーゼ消化からの2つのサンプルに対して、修飾ペプチドの連続免疫親和性濃縮を別々に実行します。
10倍濃縮イムノアフィニティー精製またはIAPバッファーを10倍に希釈します。凍結乾燥ペプチドを2, 000 Gで5分間遠心分離し、ペプチドをチューブの底までスピンダウンします。15ミリリットルのチューブあたり250マイクロリットルの希釈IAPバッファーでペプチドを再懸濁し、1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。
リトマス紙を使用して、pHが6を超えていることを確認します。後続のMS分析の入力として、各フラクションの少量のアリコートを保持します。各画分を2つの部分に分割して、非対称ジメチル化(ADMA)ペプチドと対称ジメチル化(SDMA)ペプチドの免疫濃縮を並行して行う。
プロテインAアガロースビーズに結合した選択された抗パンR-メチル化抗体のバイアルを、初期タンパク質抽出物10ミリグラムあたり3つ調製する。各バイアルを2, 000 Gで30秒間遠心分離し、ビーズからバッファーを除去することにより、アガロースビーズに結合した正しい量の抗体を調製します。ビーズを2, 000 Gで30秒間遠心分離することにより、1ミリリットルの1X PBSで3回洗浄します。
最後の洗浄後、ビーズを各バイアルの40マイクロリットルの1X PBSに再懸濁し、プールしてから、最後に16の画分に均等に分割します。各チューブに250マイクロリットルの1X IAPバッファーを加え、反転させて混合します。次に、回転ホイールでチューブを摂氏4度で2時間インキュベートします。
インキュベーション後、ペプチドとパンR-メチル抗体結合ビーズを含む1.5ミリリットルのチューブを2, 000 Gで30秒間遠心分離してビーズをペレット化し、各フラクションからのフロースルーを清潔な1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。R-monoメチル化に対する抗体に結合させたフロースルーにビーズを加え、PBSへの再懸濁、IAPバッファーとのインキュベーション、遠心分離を繰り返します。モノメチル化またはMMAビーズとのペプチドサンプルのインキュベーション中に、抗ADMAおよびSDMAで以前に免疫沈降した画分を250マイクロリットルのIAPバッファーで2回洗浄し、各洗浄後に上清を廃棄します。
その後、LC-MSグレードの水で3回洗浄します。アガロースビーズからアフィニティー濃縮SDMAまたはADMAペプチドを溶出するには、各チューブに50マイクロリットルの0.15 TFAを加えます。この溶液を室温で10分間放置し、2〜3分ごとにチューブを反転させます。
最初の溶出液を清潔な1.5ミリリットルの低結合チューブに移し、50マイクロリットルの0.15 TFAで溶出を繰り返します。2つの溶出画分を1本のチューブにプールします。抗MMA抗体ビーズと一緒にインキュベートしたR-モノメチル化ペプチドについて、このプロセスを繰り返します。
軽標識細胞と重標識細胞を混合した後、タンパク質を抽出し、トリプシンおよびリサルギナーゼによる消化を行った。SDS-PAGEクーマシー染色ゲルを使用して、ペプチド中の総タンパク質の効率的な酵素消化を検証しました。C18 Sep-Pakカラムで行った精製工程の効率を評価し、C18カラムのフロースルーおよび1回目と2回目の洗浄、および溶離液中にペプチドが存在しないことを確認しました。
重いチャネルへの適切なMET4の組み込みと、正しい重または軽混合が評価されました。ペプチドのオフライン高pH逆相液体クロマトグラフィー分画およびその後の画分の非連続連結からのクロマトグラムをここに示す。ペプチドは250ナノメートルのUVで検出され、潜在的に残っている未消化のタンパク質は280ナノメートルのUVで評価されました。真陽性メチルペプチドアノテーションを表すペプチドの完全なMSスペクトルが得られた。
3つのピーク間で観察されるMオーバーZの差は、酵素的にメチル化された残基の存在と一致する。偽陽性のメチルペプチドアノテーションを表すペプチドの完全なMSスペクトルが得られた。軽メチル化ペプチドとその懲罰的重ペプチドとの間に観察されたMオーバーZ差は、期待値から0.0312だけずれている。
プロトコルのワークフローは全体的に直線的ですが、特別な注意が必要な手順がいくつかあります。例えば、非連続画分連結によるIPHクロマトグラフィー分離、およびIPセットアップ。同じプロトコルを標準的なSILACまたはラベルフリー定量のいずれかと組み合わせて、さまざまな摂動に応答するアルギニンメチル化ダイナミクスをプロファイリングできます。
このプロトコルは、PRMTに焦点を当てた基礎研究とトランスレーショナル研究のすべての側面をサポートするいくつかの細胞タイプとモデルシステムにおけるタンパク質メチル化の範囲とダイナミクスの特性評価への道を開きます。
