著者は、有益な議論のために魚の世話のために、図4、ウルリケNehrdichとデービー·デ·ウィット内の画像、および他のラボメンバーのチャオ崔、フロア·デ·コート氏、エスターのストゥープとラルフ·カルバリョに感謝します。この作品は、経済や教育·文化·科学省のオランダ省、欧州委員会第7次フレームワークプロジェクトZF-HEALTH（健康F4-2010から242048）、欧州マリー·キュリーのスマートミックス·プログラムでサポートされています初期研修ネットワークFishForPharma（PITN-GA-2011から289209）、およびオーストラリアNHMRC（637394）で。オーストラリアの再生医学研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの補助金によってサポートされています。

<ol>
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著者らは、開示することは何もありません。

この資料に記載されている感染方法は、頻繁に自然免疫遺伝子や細菌の病原性遺伝子1の機能を研究するために使用されています。静脈内マイクロインジェクション法（プロトコル5および6.1）は、そのような研究のために最も頻繁に使用されています。後部血島で尾静脈には、1日齢の胚の静脈注射のための最も便利な場所です。尾静脈は後の段階で浸透することはより困難になるにつれ、我々は2-3 DPFにおける胚の静脈内注射部位としてキュビエ管を好む。すべてのケースでは、CFUカウントのためのメッキ注入接種によってチェックされるべき細菌の一貫した数字との胚を注入することが重要です。次の側面は、再現性の注射を達成するために考慮する必要があります。第一に、高品質のガラスマイクロキャピラリー注射針を持っていることが不可欠である。針先が大きすぎる場合は、インジェクションは発生する出血のために十分な大きさの穿刺孔を作成します。注入された細菌は、血液循環の外に流れます。第二に、細菌が血液循環に直接注入する必要があります。針の先端が卵黄嚢の拡張子への注入液のスプレッド静脈内またはそうでない場合であれば、胚は実験から破棄しなければなりません。第三に、Mを注入するためのキャリアとしてPVP40を使用して、 marinumはガラス針に沈んでから細菌を防ぐことに役立ちます。 PVP40は、注射の期間中、より再現性の接種の結果、懸濁液の均質性を向上させます。 PVP40もS.ために使用することができる大きいサイズや細菌の明るい蛍光が実験中に注射接種上のビジュアルコントロールを許可しているので、 ネズミチフス菌の注射が、ここではそれほど重要ではありません。注射を実施するための我々は、フェノールレッド染料（1％v / v）の、または1μmの異なる色（Invitrogen社製）で利用可能な蛍光球の使用をお勧めします。技術が習得されれば、約30 minutを取るESは、アガロースプレート上胚を合わせ、細菌の注入量を調整するために必要な時間を含めて、50から100の胚を注入する。 血島（プロトコル5）に、またはキュビエ（プロトコル6.1）のダクトに静脈内注射が最も一般的に使用されていますが、このビデオ資料に記載されている感染症の代替ルートは、（プロトコル6.2、6.3、マクロファージおよび好中球走化性の研究に有用であることが分かった、および6.4）、弱毒菌株（プロトコル6.5）の成長を研究するために、高スループットアプリケーションのためのゼブラフィッシュ感染モデル（プロトコル6.6）4-8を適応させる。に記載のマイクロインジェクション法もウイルス18、19、真菌の胞子14、20または原生動物の寄生虫（マリアForlenza、私信）の注射のために適用することができます。このビデオ資料に記載されている注射の手続きに便利な付加はzebrに細菌の皮下注射のために最近では説明した手順です。afish胚21。この手順は、組織の表面に効率的に巻き込む細菌に見つかっていたが好中球による細菌の貪食を研究するために適用され、マクロファージとは対照的に、血液中にまたは液体で満たされた体腔への注入時に細菌を貪食することが事実上できませんでした。皮下注射の胚については、このビデオ資料に記載されている尾の筋肉注射の場合と同様に配置されていますが、針が体節を介して細菌を注入するだけで皮膚の下に挿入されます。 マイクロインジェクションは、本質的に感染の人工的なルートであることを考慮することが重要です。しかし、初期の胚は、細菌性病原体に対する外部被曝に対して高い耐性があります。実際には、胚を細菌懸濁液に浸されている液浸アッセイは、我々の手22の再現性はありません。いくつかの胚は、浸漬に感染するかもしれませんが、我々は、死亡率や急行に大きな変化を観察しているこのようなアッセイの個々の胚の間に炎症性マーカー遺伝子のイオン。この資料に記載されているマイクロインジェクション方法は再現性の感染症を達成し、宿主生来の免疫細胞と細菌の相互作用を研究するのに特に有用である。個々の胚で細菌感染を定量化するための効率的なアプローチは、カスタムメイド、専用の画素の定量化ソフトウエア17、23に感染した胚の蛍光画像を分析することです。このアプローチは、感染した胚のめっき後のCFUカウントの結果とよく相関することが示されている。同様に、胚当たりの白血球数の相対的変化は、トランスジェニック白血球フルオロフォアレポーターラインのデジタル画像解析によって定量化されていますが、このアプローチでは感染24〜ホスト白血球産生の反応を定量化するにも適切でしょう。 宿主自然免疫遺伝子の機能について説明し、感染モデルを組み合わせることにより、 生体内で効率的に調べることができますモルホリノノックダウンした。 Morpholinosは、特定のRNAを標的とし、このジャーナル10、25の他のビデオの記事に示されているように、1細胞期のゼブラフィッシュ胚に注入する遺伝子産物の発現を軽減する合成アンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルホリノノックダウンの研究では、比較するすべての胚グループは、細菌注射の前に正しく上演されていることを非常に重要である。胚は時間の経過とともにますます有能になる発展途上の免疫システムを持っているので、これは特に重要です。 ゼブラフィッシュ胚では、主要な先天性免疫のサブセット、マクロファージおよび好中球を区別するために現在利用可能ないくつかのトランスジェニックレポーターラインがあります。 MPXとLYZプロモーターは好中球レポーターライン16、26、27を生成するために使用されており、csf1r（FMS）とMPEG1プロモーターは、マクロファージの記者14、28を生成するために使用されました。一方、CSF1R（FMS）は、さらにMPEG1発現がマクロファージで排他的ですが、xanthophoresで表されます。このビデオの記事で示したように、最近開発されたMPEG1レポーターラインはマクロファージによるイメージング細菌貪食のために非常に便利です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> サプライヤー </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td> P0290 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco社製ミドル7H10寒天培地</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBLミドルOADC濃縮</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco社製ミドル7H9ブロス</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBLミドルADCの濃縮</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 211887 </td></tr><tr><td>ツイーン80 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P1754 </td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（PVP40） </td><td> Calbiochem社、メルク</td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ em&gt;は、フェニルチオ尿素（PTU） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P7629 </td></tr><tr><td> 3 - アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（Tricaine） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A5040 </td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaqueアガロース（低融点アガロース） </td><td>ロンザ社</td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres（1.0μmの、赤色蛍光（605分の580）） </td><td>インビトロジェン</td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres（1.0μmの黄緑色蛍光（515分の505）） </td><td>インビトロジェン</td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の胚がますます宿主-病原体相互作用の1の脊椎動物の自然免疫系の機能を研究するためのモデルとして使用されています。自然免疫系の主要な細胞型、マクロファージおよび好中球は、免疫応答に必要とされるリンパ球の成熟の前に胚発生の最初の日の間に開発しています。胚の大量入手のしやすさ、外部の開発のために、アクセシビリティ、胚および幼虫の光透過性、遺伝的なツール、トランスジェニックレポーターラインの大規模な変異体リソースやコレクションの広い範囲は、すべてのゼブラフィッシュの汎用性を追加モデル。 サルモネラ血清型Typhimuriumの（ネズミチフス菌）と結核marinumは、マクロファージに細胞内に存在することができ、頻繁にゼブラフィッシュ胚における宿主-病原体相互作用を研究するために使用されます。これら二つの感染過程細菌の病原体は、比較することは興味深いものですので、S.ネズミチフス菌感染症は、M.、一方、1日以内の急性および致命的であるmarinum感染症は慢性的であり、幼虫2、3までイメージングすることができます。胚（ 図1）に細菌の微小注射部位の感染が急速に全身になるか、最初にローカライズされたままかどうかを決定します。急速な全身感染症が直接後部血島で、またはキュビエ、トランク血管系に心を接続する卵黄嚢の広い流通チャネルのダクトを介して尾静脈を介して血液循環にマイクロ注入細菌によって確立することができます。 1 DPFで、この段階で胚がphagocyticallyアクティブマクロファージを持っていますが、好中球はまだ血島に注入し、成熟していない場合が好ましい。 2月3日DPFにおける注射のために、胚は、機能（ミエロペルオキシダーゼ産）好中球を開発しているときは、キュビエのダクトはtとして好ましい彼は、注射部位。ローカル感染症に対する骨髄細胞の指示への移行を検討するため、細菌は、尾の筋肉、耳胞、あるいは後脳室4から6に注入することができます。さらに、脊索、骨髄系細胞に正常にアクセスできないように見える構造は、局所感染、7〜非常に敏感です。ハイスループットアプリケーションのための有用な代替手段は受精後の最初の8時間以内に胚の卵黄への菌の注射である。蛍光マクロファージや好中球と蛍光細菌およびトランスジェニックゼブラフィッシュラインを組み合わせることにより、宿主 - 病原体相互作用のマルチカラーイメージングのための理想的な状況を作成します。このビデオの記事はSでゼブラフィッシュ胚の静脈内投与と局所感染の詳細なプロトコルを記述します。 ネズミチフス菌またはM. marinum細菌と自然免疫系の細胞との相互作用のその後の蛍光イメージングのために。

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明している<em&gt;ネズミチフス菌</em&gt;と<em&gt;結核marinum</em&gt;。細菌のマイクロインジェクションやマルチカラー蛍光イメージングは​​、ゼブラフィッシュ胚の感染モデルのアプリケーションに関与する必須の技術です。

細胞内細菌性病原体を持つゼブラフィッシュ胚の感染

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

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Immunology and Infection

43.4K ビュー.  Leiden University. 透明なゼブラフィッシュの胚は、次のような視覚化するための有用なモデルのホストと自然免疫細胞と細胞内細菌性病原体との間の機能的研究の相互作用を、証明しているネズミチフス菌と結核marinum。細菌のマイクロインジェクションやマルチカラー蛍光イメージングは​​、ゼブラフィッシュ胚の感染モデルのアプリケーション?...