タンパク質産生合成細胞は、高度な薬物送達のための合成細胞ベースの治療法と同様に、生命の起源を研究するための汎用性の高いプラットフォームを提供します。この方法は、RNAおよびタンパク質発現のためのシンプルで手頃な価格であり、体内で直接オンサイト治療タンパク質の生産に適用することができます。このシステムは、代謝疾患やタンパク質置換から癌、糖尿病に至る幅広い疾患の治療に使用できます。
この複数ステッププロトコルには、定義された停止点があります。初めて実行する場合は、数日間にわたって作業を分割することをお勧めします。合成細胞製造のためのプロトコルは、細胞を含まないS30-T7リセートの調製から始まります。
次に、膜脂質と細胞栄養溶液は、内部環境をシミュレートし、タンパク質の生産をサポートするために準備されます。最後のステップは、合成細胞自体の調製です。100ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで重複したスターター培養を準備します。
各フラスコに、アンピシリン1ミリリットル当たり50マイクログラムを添加したLB培地5ミリリットルを加え、単一の大腸菌コロニーで接種する。250 rpm と 37°C で床インキュベーター シェーカーで一晩培養を育てる。次に、500ミリリットルの結核培地を含む2リットルのバッフル・エルレンマイヤーフラスコを調製し、1ミリリットルのアンピシリン当たり50マイクログラムを補う。
5ミリリットルのスターター培養で各2リットルフラスコを接種する。フラスコを250rpmと37°Cのシェーカーに入れます。分光光度計を使用して培養物を定期的に監視し、0.8~1のOD600まで培養を成長させます。
T7 RNAポリメラーゼの発現を誘導するには、各フラスコに100ミリモルIPTGの3ミリリットルを加え、0.6ミリモルに達する。OD600が約4になるまで培養を続けます。培養物が所望の光学密度に達した後、各エルレンマイヤーフラスコから250ミリリットルの殺菌された遠心分離管に懸濁液を移す。
チューブを摂氏4度で10分間7,000倍に遠心します。上清を捨てます。必要に応じて攪拌機を使用して、各ペレットを250ミリリットルの冷たいS30溶液緩衝液で再懸濁する。
摂氏4度で10分間、7,000倍gの遠心分離機。上清を捨て、冷たいS30ライセートバッファーの15ミリリットルですべてのペレットを再懸濁します。ガーゼパッドを使用して懸濁液をフィルターします。
次のステップに進む前に、ライセートを保存するために必要な1.5ミリリットルバイアルでチップを予冷します。懸濁液を2回均質化する。細胞破損のための4つの棒の空気圧の15,000 PSIの働く圧力を使用する。
ホモジネートを収集します。均質化懸濁液の10ミリリットルあたり0.1モルDTTの100マイクロリットルを加える。24、摂氏4度で30分で700回gでサスペンションを遠心分離する。
DTTとクロロホルムは刺激性と有害に分類されるため、注意して扱う必要があります。プロトコルで後述するクロロホルムは、ヒューム抽出のある領域で使用する必要があります。ライセート活性を維持するには、迅速にステップを実行します。
あらかじめ冷却されたバイアルに上澄み液の200マイクロリットルのアリコートを入れ、すぐに液体窒素でそれらを凍結します。バイアルは、将来の使用のためにマイナス80°Cで保存してください。別々にクロロホルムでPOPCとコレステロールを溶解します 1 ミリリットルあたり 100 ミリグラムの最終濃度.
各バイアルを別々に渦。2ミリリットルのガラスバイアルにコンポーネントを組み合わせます。コレステロール-クロロホルム溶液50マイクロリットル、POPC-クロロホルム溶液50マイクロリットル、ミネラルオイル500マイクロリットルを加えます。
バイアルをボルテックスし、クロロホルムを蒸発させ、化学フードで摂氏80度で約1時間加熱する。合成細胞製造段階を開始する前に、原稿に記載されているように外液、プレインナー、および給餌液を調製する。その後、15ミリリットルのチューブに外側溶液の1.2ミリリットルを入れ、最初のガラスバイアルから500マイクロリットルの脂質油中溶液の層をゆっくりと追加します。
室温でチューブを20分間インキュベートします。内部溶液の調製を確定するには、S30-T7溶解液およびDNAプラスミドを添加して、氷上で100マイクロリットルの最終体積に混ぜます。500マイクロリットルの脂質油中溶液を用いて、2ミリリットルのガラスバイアルに溶解液とプラスミドを使用して100マイクロリットルの内部溶液を加えます。
ピペットは1分間激しく上下し、レベル5でさらに1分間渦巻きします。得られたエマルジョンを砕いた氷の上で10分間インキュベーションした後、15ミリリットルチューブの油相の上にエマルジョンをゆっくりと加える。チューブを100倍gと摂氏4度で10分間遠心分離します。
その後、400倍gと摂氏4度で10分間遠心分離機。遠心分離の終わりまでに、ペレットはチューブの底部で観察可能であるべきです。ペレットを抽出するには、まず余分な油層を除去する。
次に、約400マイクロリットルの外側溶液でトリミングされたピペットチップをロードし、ピペットチップを使用してペレットを採取し、ピペットチップが油相を通過する際に外側溶液を放出する。ピペットチップを拭き、ペレットをきれいな1.5ミリリットルのチューブに移します。ペレットを1,000倍gと摂氏4度で10分間遠心します。
上清を取り除き、100マイクロリットルの供給溶液でペレットを再懸濁します。タンパク質発現の場合は、振盪することなく摂氏37度で2時間の懸濁液をインキュベートします。モデルタンパク質sfGFPおよびレニラルシメラーゼを発現するプラスミドを無細胞タンパク質合成、CFPSバルク反応、および合成細胞に導入した。
タンパク質の産生は、いくつかの方法を用いて評価した。ウェスタンブロット分析は、CFPSバルク反応と合成細胞内部の両方でsfGFP His6産生を検出した。精製されたsfGFP His6は陽性対照として使用した。
ブライトフィールドとGFPフィルターを備えた蛍光顕微鏡は、sfGFPを産生している合成細胞を示しています。フローサイトメトリーを用い、sfGFP産生合成細胞を分析した。活性合成細胞集団の計算は、赤色ヒストグラムで表される陰性DNAサンプルで定義されるsfGFP蛍光強度閾値に基づいていた。
合成細胞を産生するsfGFPの平均蛍光強度は、活性合成細胞集団から算出し、陰性DNA試料に正規化した。活性合成細胞の直径分布はsfGFP信号に基づいて算出した。ルシメラーゼ活性を発光測定で定量した。
この方法は非常に汎用性が高く、溶解物の起源、脂質組成および内部溶液濃度を変化させることによって異なる標的タンパク質に対して最適化することができる。蛍光マーカータンパク質を産生する合成細胞のFACS分析を行い、活性合成細胞の画分の定量値を提供することができる。ウェスタンブロット分析はタンパク質の産生を測定するであろう。
