無細胞自己誘導法は、研究者の監督と機能的な細胞抽出物の生産に必要な時間を短縮します。これにより、より時間と負荷のかかる以前のインビトロタンパク質合成プロトコルが簡素化されます。この手法は、それほど複雑ではなく、収率も高いため、より多くの聴衆が無細胞表現を実装することができます。
この方法は、細胞増殖中および無細胞反応におけるエネルギー代謝の重要性を強調する。まず、960ミリリットルの無細胞自己誘導培地を調製することから始めます。その後、2.5リットルのバッフル付きフラスコで、摂氏121度で30分間オートクレーブ処理して培地を滅菌した。
次に、40ミリリットルの糖化液を調製した後、それを別のオートクレーブ処理されたガラス容器に濾過滅菌する。オートクレーブ処理後、培養培地が摂氏40度以下に冷却されたら、フィルター滅菌した糖溶液を培地に直接加える。次に、以前に縞模様の新鮮な大腸菌BL21スタープレートからコロニーでいっぱいのループをスワイプし、ループを培地に直接挿入することによって、培地を接種する。
容器の側面に触れずにループをメディアに渦巻きます。次いで、接種培地を摂氏30度のインキュベーター内に一晩入れ、200RPMで振とうした。翌日、1リットルの培地を1リットルの遠沈瓶に移し、4〜10°Cの間で5,000倍Gで10分間遠心分離することによって細胞を回収する。
上清を捨てた後、滅菌ヘラを使用してペレットを予め冷却し、予め秤量した50ミリリットルの円錐管に移す。次に、氷上の休息期間とともに30秒間のバーストでボルテックスを介してペレットを再懸濁させることによって、ペレットを30〜40ミリリットルの冷たいS30緩衝液で1回洗浄する。ペレットが完全に再懸濁された後、細胞再懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、そしてきれいな組織を用いて、ペレットに触れることなく50ミリリットルチューブの内壁から余分な上清を拭き取る。
その後、液体窒素中で急速凍結する前にペレットを計量し、さらに使用するまでマイナス80°Cで保管してください。細胞抽出物を調製するために、凍結細胞ペレットのグラム当たり1ミリリットルのS30緩衝液を添加し、ペレットを氷上で30〜60分間融解させる。その後、融解したペレットを30秒間のバーストでボルテックスで再懸濁し、目に見える細胞凝集塊が残らなくなるまで氷上で休息期間をとります。
細胞溶解のために、細胞懸濁液の1.4ミリリットルアリコートを1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移す。その後、氷浴中でサイクルごとに59秒の休息で45秒の3つのバーストのための20キロヘルツと50%の振幅の周波数で各チューブ内の細胞懸濁液を超音波処理サイクル間でチューブを反転させ、最後の超音波処理サイクルの後、すぐに1モルジチオスレイトールの4.5マイクロリットルを追加します。すべてのチューブで細胞懸濁液を超音波処理した後、チューブを遠心分離し、新鮮な1.5ミリリットルマイクロフュージチューブに600マイクロリットルのアリコートで上清を収集します。
アリコートをフラッシュフリーズし、さらに使用するまでマイナス80°Cで保管してください。1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブで15マイクロリットルの無細胞タンパク質合成反応を4連で行うには、細胞抽出液の1アリコートを解凍する。各15マイクロリットルの反応混合物を調製した後、反応を摂氏37度で少なくとも4時間実行させる。
レポータータンパク質を定量するには、pH 7.2で48マイクロリットルの50ミリモルHEPES緩衝液を、黒色ポリスチレン96ウェルプレート中の各無細胞タンパク質合成反応産物2マイクロリットルと組み合わせる。スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質、またはsfGFPの蛍光強度を、励起波長485および発光波長528ナノメートルを用いて定量する。次いで、精製pJL1 sfGFPプラスミドを用いて標準曲線を作成することによって相対蛍光単位をsfGFPの体積収率に変換する。
ここに示されているのは、600ナノメートルで測定された異なる光学密度での細胞回収後の無細胞自己誘導培地ペレットである。光学密度10に成長した培地は、光学密度2.5に成長した培地よりも、抽出物全体でより多くの量の細胞ペレットを生成した。総タンパク質濃度のさらなる分析は、両方の抽出物間の全体的なタンパク質に有意差を示さなかった。
培地を異なる光学密度レベルに増殖させたにもかかわらず、両方の抽出物は、sfGFPを発現する無細胞反応において同様の結果を示した。培地および糖溶液を調製しながら滅菌条件を維持することは重要である。このCFAI細胞抽出法は、無細胞発現のほとんどの用途に使用することができる。
これらは、バイオテクノロジー教育からタンパク質工学、ポイントオブケア診断まで多岐にわたります。この方法は、必要な時間と技術的スキルの量を減らし、再現性を向上させ、そしてより多くの量の抽出物を生成する。
