このプロトコルは、ネイティブの大腸菌パラメータからでも、無細胞タンパク質合成システムで線形DNAテンプレートを迅速、簡単、直接使用できるため、非常に重要です。主な利点は、クローニング、線状DNA末端の化学修飾、ガンマやカイDNAなどの保護サプリメントを避けることで時間を節約できることです。関心のあるさまざまな生物の自己報告合成抽出物が開発されているため、私たちの方法は、線状DNAを使用してそれらの抽出物のプロトタイピングをスピードアップする方法を提示します。
まず、摂氏マイナス80度のグリセロールストックから、1ミリリットルのクロラムフェニコールあたり10マイクログラムを含む2x YTP寒天プレートにストリーク株BL21ロゼッタ-2デルタrecBCDをストリークし、摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、寒天プレートから1ミリリットルあたり10マイクログラムのクロラムフェニコールを添加した40ミリリットル強の2x YTPに単一のコロニーを接種し、摂氏37度で200RPMを振とうしながら一晩インキュベートします。次に、一晩培養液を100倍に希釈して、クロラムフェニコールあたり10マイクログラムを含む新鮮な2x YTP培地4リットルに希釈して継代培養を行います。
4リットルの培地を4つの別々のフラスコに分けます。摂氏37度、200 RPMで約3〜4時間の成長でインキュベートし、1.5〜2.0の光学密度に達します。培養液を氷上に置き、摂氏4度で12分間5, 000 Gで細胞を回転させ、デカントして上清を捨てます。
次いで、細胞ペレットをDTTと共に800ミリリットルのチルドS30Aに再懸濁する。繰り返しますが、前に示したように、摂氏4度で12分間5, 000 Gで細胞をスピンダウンし、デカントによって上清を廃棄します。細胞ペレットをDTTで160ミリリットルのチルドS30Aに再懸濁した後、細胞をチルドして事前に計量した50ミリリットルのチューブに移します。
細胞を摂氏4度で8分間2000Gでスピンダウンし、デカンテーションによって上清を廃棄します。再度、摂氏4度で2000 Gで4分間細胞をスピンダウンし、ピペットを使用して残りの上清を注意深く取り除きます。次に、チューブの重量を再測定してセルペレットの重量を計算し、セルペレットを摂氏マイナス80度に保ちます。
細胞ペレットを摂氏マイナス80度から採取した後、氷上で1〜2時間解凍し、細胞ペレットの重量1グラムあたりDTTバッファーを含む0.9ミリリットルのS30Aに細胞ペレットを再懸濁します。その後、ゆっくりとピペットで細胞を再懸濁し、上部の泡をできるだけ避けます。再懸濁した細胞の1ミリリットルのアリコートを1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れ、氷上または摂氏4度で事前に冷やしたコールドブロックに保ちます。
次に、3サイクルで20%振幅のセットアップで超音波処理器で各チューブを超音波処理し、摂氏4度で10分間12, 000Gでライセートをスピンダウンします。ピペットで上清を回収した後、50ミリリットルのチューブに移します。細胞ライセートを摂氏37度、200 RPM攪拌で80分間インキュベートします。
ライセートをスピンダウンし、上清をプレチルド1.5ミリリットルのマイクロチューブに回収した後、すべてのチューブを氷上に保ちながら、プレチルドPCR8ストリップチューブに30マイクロリットルを分注します。ライセートのアリコートをドライアイスで瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で保管します。原稿に記載されているバッファー調製タブに従ってマスターミックスを準備します。
反応容量が10.5マイクロリットルの場合は、1.05マイクロリットルの異なるMg-グルタミン酸ストック濃度と9.45マイクロリットルのマスターミックスを加え、穏やかに混合します。上記の反応物10マイクロリットルを384ウェル角底マイクロプレートにピペットし、粘着プレートシールを用いて蓋をする。プレートリーダーで蛍光データを一定間隔で記録し、摂氏30度で8時間インキュベートし、毎分307サイクルで連続的に軌道振とうすることにより、遺伝子発現を蛍光出力として測定します。
終点で最も高い蛍光値をもたらすMg-グルタミン酸濃度を特定した後、K-グルタミン酸キャリブレーションに進みます。実験を実行し、テストしたK-グルタミン酸濃度の中から最高の蛍光値を特定し、このライセートのMg-グルタミン酸およびK-グルタミン酸に最適なバッファー組成を特定します。Mg-グルタミン酸およびK-グルタミン酸の値が確立されたら、得られたバッチ量に従って最適化されたバッファー組成のストックチューブを調製する。
必要なバッファーチューブの数を計算した後、チューブあたり38マイクロリットルを分注し、摂氏マイナス80度で保管します。まず、最適なマスターミックス調製のために1.5ミリリットルのマイクロチューブにラベルを付けます。適切な量のバッファーとライセートを加え、穏やかに混合します。
次に、最初にDNAサンプルをピペットでピペットし、次にヌクレアーゼフリーの水をピペットで、最後に最適なマスターミックスを行います。プレートリーダーに加える直前に、無細胞反応をピペットで穏やかに混合し、気泡を避けます。プレートリーダーで反応を設定した後、キネティックランは、毎分307サイクルで連続軌道振とうしながら、摂氏30度で8時間のインキュベーションのために一定の間隔で蛍光データを記録しました。
ライセートのキャリブレーション後、Mg-グルタミン酸の最適濃度は、直鎖DNAとプラスミドDNAの両方の抽出物全体で8ミリモルで類似していました。ただし、プラスミドDNAの最適なK-グルタミン酸濃度は140ミリモルですが、直鎖状DNAの最適なK-グルタミン酸濃度は20ミリモルです。キャリブレーションステップの後、野生型、デルタrecB、およびデルタrecBCD抽出物の直鎖DNAとプラスミドDNAの間でGFP発現のレベルを比較しました。
直鎖状DNAからのGFP発現は、デルタrecBおよびデルタrecBCD株からの抽出物におけるプラスミドDNAからの発現のそれぞれ102%および138%に達した。プロトコルで最も重要なことは、細胞の超音波処理溶解と、特にネイティブパラメータを使用する場合、線状DNAとプラスミドDNAのバッファーキャリブレーションステップを別々に行うことです。この技術は、バイオセンサー、酵素、経路のスクリーニング、合成遺伝子回路のプロトタイピングなど、無細胞系での生物学的設計のテストをスピードアップするのに役立ちます。
