このプロトコルは、合成施設から受け取った小さな遺伝子断片から無細胞反応に使用する大量のDNAテンプレートを迅速に生成する方法を詳述しているため、重要です。転環増幅は、従来のクローニングよりも速く大量のDNAを生成することができます。したがって、合成DNAのライブラリからサイクルを学習する高スループット設計ビルドテストをサポートします。
これらの手法は、多くのステップと少量のボリュームが必要なため、新規ユーザーに対して大きな固有の変動を持つことができます。技術には細心の注意を払う必要があり、練習は完璧になります。まず、PCR キットのすべてのコンポーネントを 1 つの PCR チューブに追加します。
次に、再懸濁された遺伝子断片の1マイクロリットルを加える。培地設定で5~10秒間ボルテックスを行い、混合物を穏やかに均質化します。キットメーカーのプロトコルに従ってサーモサイクラーをプログラミングした後、PCRを実行します。
PCRが完了したら、PCR クリーンアップ キットを使用して、反応ミックスから DNA を精製します。1.5ミリリットルチューブに、DNA結合バッファーとPCRサンプルを5対1の比率で加えます。この混合物を16,000回Gのスピンカラムと遠心分離機に1分間移します。
フローを破棄します。200マイクロリットルのDNA洗浄バッファーをカラムに加え、室温で1分間インキュベートします。列を再び遠心分離し、フロースルーを破棄します。
実証されているように、DNA洗浄バッファーでカラムをもう一度洗います。2回目の洗浄からフロースルーを破棄した後、残りのバッファーを遠心してさらに1~2分間遠心して取り除きます。DNAを溶出するには、カラムを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。
その後、カラムに46マイクロリットルの二重蒸留水を加えます。1分間のインキュベーションの後、遠心分離によってDNAをチューブに集める。そして分光光度計を用いて精製されたDNAを定量化する。
DNAを消化して円形化するには、必要な反応バッファーの5マイクロリットル、20単位のHindIII制限酵素、および精製されたDNAの45マイクロリットルをPCRチューブに組み合わせます。ピペットを使用して、この混合物を穏やかに均質化します。その後、サーモサイクラーで摂氏37度で15分間インキュベートします。
インキュベーションが完了した後、80°Cで20分間インキュベートすることによってHindIII酵素を加熱不活性化する。次に、T4リガーゼバッファーの5マイクロリットルとT4リガーゼの800単位を新たに消化したDNAに加えます。ピペットと軽く混合した後、25°Cで1時間インキュベートし、循環反応を行います。
反応が完了したら、前述のように PCR クリーンアップ キットを使用して DNA を精製します。その後、DNAを定量化します。転環増幅を行うために、精製された円形化発現テンプレートのすべての反応成分と1マイクロリットルを1本のチューブに結合する。
混合物をピペットとアリコート10マイクロリットルの混合物を4つの別々のチューブに均質化する。チューブを摂氏30度で4~18時間インキュベートし、65度で10分間インキュベートして酵素を不活性化します。熱不活性化後、摂氏12度で5分間インキュベートすることで、チューブ底部の結露を促します。
次に、各チューブに15マイクロリットルの二重蒸留水を加えて得られた溶液を希釈する。前に示したようにDNAを精製し、定量化する前に、各チューブの内容物を組み合わせます。無細胞反応を行うために、必要な様々な成分をチューブに加え、最終的な必要量に二重蒸留水で希釈します。
溶液の半分を上下に10~20回ピペット化して、溶液を十分に混ぜます。15マイクロリットルのアリコートで反応混合物をマイクロティタープレート内の所望のウェルに移します。その後、湿度を維持し、蒸発を防ぐために、無色のシールフィルムでプレートを密封します。
プレートリーダーに密封プレートを置き、反応を完了させます。無細胞系を用いてサブチレシンBPN遺伝子を発現する場合、アリコート94マイクロリットルの二重蒸留水と10マイクロモルPNAの1マイクロリットルを平底、無色96ウェルプレートに含む。その後、完成した無細胞反応の5マイクロリットルを加え、25°Cの温度を維持しながら10分間、20秒ごとに410ナノメートルで吸光度を測定するためにセットされたプレートリーダーを使用してプレートを読み取ります。
BL21 DE3スター抽出物中のスーパーフォルダGFPの発現は、15マイクロリットル反応で3マイクロリットルの未精製RCA DNAのみを使用して、PJL1プラスミドのそれと同等である。テンプレートの量を倍増して3倍にすることは明らかな利点を提供していないようで、反応あたり3マイクロリットルですでに飽和レベルのテンプレートを示唆しています。逆に、シャッフル歪みセル抽出物を使用する場合、RCAテンプレートの量を増やす利点があるようです。
より低い温度または長い折りたたみ時間を必要とするタンパク質は、ワークフロー全体を完了するために必要な時間に影響を与えます。例えば、4時間の発現後にサチリスチンをアッセリングすると、4時間はサブチラシン成熟には不十分であるため、失敗した結果をもたらす。しかし、反応を16時間継続することを可能にすることは、検出可能なレベルのサブチリシンにつながる。
このプロトコルが最大限の効率で動作するためには、すべてのコンポーネントが適切に混在している必要があります。これらの方法に従って、タンパク質候補の大規模なライブラリーを合成的に生成し、次いで特性評価に十分な収率で発現させることができる。この方法により、細胞抽出物で働くNC2センサーを開発する道が開き、プロトタイプタンパク質を迅速に特徴付けることができます。
これにより、新しいバイオ触媒や治療法のタンパク質設計をより迅速かつインテリジェントに繰り返し処理できるようになります。
