無細胞タンパク質発現のための私達のプロトコルは、簡単で時間効率の2段階の超音波処理遠心プロセスを使用して調製される急速に成長している細菌ビブリオナトリーゲンからの非常に活性な粗抽出物を利用する。粗細胞抽出物調製および無細胞タンパク質合成は、この技術をバイオプロダクションまたは合成生物学の用途のパイプラインに容易に統合することを可能にする単一のユーザーによって1〜2日で達成することができる。一晩ビブリオナトリゲン培養物の1ミリリットルをベンチトップ遠心分離機で10,600回gで1分間洗浄し始める。
ペレットを乱さずに上清を吸引し、新鮮なLB-V2培地の1ミリリットルで再懸濁する。洗浄された一晩培養物の1ミリリットルを、無菌カバー付きのオートクレーブ4リットルバッフルエルレンマイヤーフラスコに1リットルの新鮮なLB-V2成長培地に接種し、1~1,000の希釈配給を達成する。225 RPMに振りながら摂氏30度で培養を成長させます。
分光光度計を使用して、培養OD 600を監視する。そして、それが1.0プラスマイナス0.2に達すると、3で2つの500ミリリットルチューブで遠心し、摂氏4度で20分間500回gを収穫し、氷の上に置きます。上清を吸引し、すぐにペレットを処理します。
細胞のリシス手順を開始する前に、冷却して調製したS30のライシスバッファーpH 7.7〜約4°Cまで、この冷たいS30ライシスバッファーの10ミリリットルを使用して、同じ1リットル培養から生じるすべてのペレットを再懸濁します。そして、50ミリリットルのチューブにサスペンションを移します。この懸濁液を3、500倍のgで摂氏4度で10分間遠心し、ペレットを乱さずに上清を吸引し、氷の上に置く。
冷たい部屋で働くことは氷の上に置かれる50ミリリットルの管の小さい部分に500マイクロリットルの冷たいS30のリシスの緩衝液を加える。広いボアピペットチップを使用してペレットを再懸濁し、氷上でも慎重に2ミリリットルチューブに移します。非常に活性な粗抽出物を生成するためには、細胞がS30バッファーで希釈されていないが、効率的な超音波処理のための十分な液体を持っていることを確認する必要があります。
600ミリリットルのビーカーに氷を入れ、氷の上に2ミリリットルのチューブホルダーを置きます。細胞を均質化するためにチューブを短時間渦に入る。フリックしてキャップの底面にあるセルを取り除き、キャップを開けたチューブホルダーに入れします。
液体表面のすぐ下にあるように、チューブ内の細胞懸濁液に低い超音波処理器の先端。1/8インチの先端径を持つ超音波処理器とプローブを使用して超音波処理のセットアップを準備します。20キロヘルツ周波数と50%振幅に超音波処理器を設定します。
パルスオン時間は10秒、パルスオフ時間は60秒。3サイクルのパルス超音波処理プロトコルを実行します。そして、遠心分離機粗細胞抽出物は、リセートが細胞の破片を含まないまで、摂氏4度で30〜45分間16,000倍gで抽出する。
超音波処理が行われるように細胞のリシスを視覚的に検査することは、超音波処理が期待どおりに機能していることを確認するために重要です。冷たい部屋で働くことは、ペレットを乱さないように確認する新しい2ミリリットルのチューブに得られた上清の50マイクロリットルをアリコート。これらの粗細胞抽出物をフラッシュフリーズするには、チューブを浸漬ストリングを取り付けたチューブホルダーに入れ、液体窒素を含むデュワーに沈水し、凍結しているかどうかを確認します。
DNAテンプレートを使用して無細胞タンパク質発現を行うために、10Xエネルギー溶液マスターミックスを解凍し、4Xアミノ酸マスターはアリコートを混合し、DNAテンプレートを室温で混合した。その後、T7 RNAポリメラーゼとRNAse阻害剤ストックをマイナス20°Cの冷凍庫から取り除き、氷の上に置きます。DNAテンプレート、10Xエネルギー溶液マスターミックス、および4Xアミノ酸マスターミックスが解凍されると、氷の上に置かれます。
氷上の2ミリリットルのチューブに正確な順序で各成分を追加することにより、無細胞反応マスターミックスを準備し、マスターミックスに追加するたびにチューブを静かにフリックします。マイナス80度の冷凍庫からビブリオ・ナトリーゲンの粗細胞ライセートを取り出し、解凍するまで10〜20分間氷の上に置きます。解凍した粗細胞抽出物の適切な量を無細胞反応マスターミックスに加え、ピペットを使用して穏やかに混ぜます。
熱サイクラーを用いたエンドポイント無細胞タンパク質発現を行うために、まず96ウェルPCRプレートの底部のウェルごとに10マイクロリットルの無細胞反応マスターミックスを加え、各転移の間にチューブをそっとフリックしてマスターミックスを混合します。プレートを1,000回gで10秒間遠心し、井戸の側面に貼り付けられていた可能性のあるマスターミックスをプールします。そして、蒸発を防ぐためにプレート接着剤で井戸を密封します。
熱い蓋を摂氏105度に設定して、摂氏26度に設定したサーモサイクラーにプレートを置きます。PCRプレート内の反応を最低3時間インキュベートした後、発現したタンパク質を精製、定量、下流工程に使用することができます。無細胞タンパク質発現キネティクスを、透明なガラス底を有する黒い384ウェルアッセイプレートの底に混ぜた無細胞反応マスターのウェルあたり10マイクロリットルのプレートリーダーピペットを使用して、キネティクスを監視する。
そして、蒸発を防ぐために透明なプレート接着剤で井戸を密封します。アッセイプレートを摂氏26度に設定したプレートリーダーに入れ、発現タンパク質に対応する適切な蛍光励起/発光波長を監視しながら3〜6時間インキュベートします。このプロトコルに記載された無細胞発現系は、エンドポイントおよび運動アッセイで示されるのと同じ量の線形DNAよりも有意に高い量のタンパク質を得るプラスミドDNAテンプレートで最良の結果を達成する。
インビトロ転写反応によって生成されたmRNAも使用できるが、より多くの量のmRNAが必要である。タンパク質産生の収率は、マグネシウムおよびカリウムイオンの濃度によって有意に影響を受けた。最適な条件下で最適なマグネシウムイオン濃度は3.5ミリモル、カリウムイオン用80ミリモルであることが判明した。
したがって、これらの最適なイオン濃度からの偏差は、タンパク質の有意な収率を生成するために、この発現系のための容量の低下をもたらす可能性があります。氷の上にすべての試薬を保管するか、可能な限り冷たい部屋で作業することが重要です。さらに、適切かつ完全な超音波処理は、このプロトコルの成功に不可欠です。
このプロトコルに従って、ユーザーは、多くの異なるタンパク質の活性を浄化し、スクリーニングするために使用することができるハイスループット形式でタンパク質を発現する能力を有する。この技術は、無細胞表現のためのユニークな特性を持つ新しい生物の使用を実証する。ビブリオ・ナトリゲンは、確立されたモデル生物で未踏のタンパク質または小分子の発現に特有の条件を提供する可能性のあるハロミリックな急速に成長する細菌である。
