我々のプロトコルを用いて、液体状のバイオインク希釈液の多層化は、カプセル化された細胞の均質な分散を促進するだけでなく、細胞に適したバイオインク環境を維持する。界面張力を利用してバイオインク貯蔵所内のカプセル化された細胞の沈殿を止め、押出印刷中の細胞への高いせん断応力負荷を回避します。この技術を用いて、均質な細胞分布を有する3D組織構造を生成し、薬物スクリーニングおよび再生医学研究に使用する機能的なインビトロ組織型を提供することができる。
バイオインクを調製する際には、これらの要因がインクの品質に影響を与える可能性がありますので、実験温度とハイグローゲルローディング手順に注意を払うことが重要です。準備を始める前に、0.22マイクロメートルの注射器フィルターユニットを使用してすべての材料を殺菌し、ゼラチンを生物学的安全キャビネットの50°C-摂氏PBSで10%の最終濃度に溶解します。メタクリル無水物を0.6~1重量比でゼラチン溶液に加え、50°Cで少なくとも1時間ゆっくり撹拌します。
インキュベーションの終わりに、混合溶液を無菌50ミリリットルチューブに移し、遠心分離によって溶液を層に分離する。上のGelMA層を収集し、40〜50°Cの脱イオン水の2つのボリュームで収集した溶液を希釈します。12~14キロダルトンの分子量遮断透析膜を40~50°Cで5~7日間、40~50°Cで透析し、1日2回水を交換します。
透析の終わりに、GelMA溶液をマイナス80°Cで一晩凍らせます。次に、マイナス45度の凍結乾燥機と0.2ミリバールの圧力でGelMA溶液を3〜5日間凍結乾燥させます。次いで、10%のウシ胎児血清、25ミリモルHEPES、および0.5%光刺激剤を補充したPBS中の凍結乾燥ゲルMAを溶解する。
シルクフィブロインGelMAバイオインを得るために、表に示されているように、初期シルクフィブロイン溶液とPBSの異なる量とGelMA溶液を混合します。すべてのバイオインクが準備されたら、10〜20分間溶液を超音波処理します。インクが超音波処理されている間、80%コンフルエントNIH / 3T3細胞培養物からバイオインク溶液あたり15ミリリットルの円錐管に細胞を採取し、遠心分離によって細胞をペレットします。
その後、上清を慎重に吸引し、バイオインク溶液濃度の6細胞に10倍の10で2ミリリットルのバイオインクを各チューブ内の細胞を再懸濁させる。印刷用にバイオインクをロードするには、細胞を含むシルクフィブロイン0.5 GelMAの吸気400マイクロリットルを2ミリリットルのシリンジの底層に加えます。シリンジをゼロ摂氏氷水浴に5分間置き、最下層のバイオインクをゲル状態に変換してから、シルクフィブロイン0.5 GelMAの層に400マイクロリットルのセルを含んだシルクフィブロイン0.75 GelMA bioinkをセットする前に下層ビオインクをゲル状態に変えます。
その後、5分間氷浴に注射器を戻し、細胞を含むバイオインクの濃度を同じようにシリンジに加え続ける。異なる層内にシルクフィブロインの異なる濃度を有する多層バイオインク系が達成された場合、37°Cのインキュベーターでバイオインクを30分間再加熱する。インキュベーションの最後に、27ゲージの印刷ノズルをシリンジに積み込み、流速を毎分50マイクロリットル、ノズルの移動速度を毎秒2ミリリットル、ノズルの高さを1ミリメートルに設定します。
次に、室温でカスタムメイドのバイオプリンターを使用して組織構築物を押出様式で印刷し、バイオプリント組織構築物を365ナノメートルの紫外線で800ミリワットで40秒間架橋する。次に、DMEMにおける架橋組織構築物を、細胞培養インキュベーターで10%のウシ胎児血清および1%ペニシリン連鎖菌を添加して培養し、最初の2日間および2〜3日ごとに8時間ごとに培地を変化させる。この代表的な分析では、バイオプリンティング手順が進むにつれて、標的ウェル内の細胞の密度は、すべての群において減少した。
シルクフィブロインゼロGelMA群では、約70%の細胞を底層に堆積させた。シルクフィブロイン1つのGelMA群では、約40%の細胞を底層に堆積させ、そして約5%の細胞を最上層に沈着させた。シルクフィブロイン多層GelMA群では、カプセル化された細胞の堆積は、対照群のそれよりも均質であった。
このプロトコルの最も重要な部分は、SF-GelMA バイオインクマルチレイヤのローディングです。このプロトコルは、液体状のバイオインクを使用する他の押出バイオプリンティング分析に適用され得る。
