移植モデルは、しばしば外科の専門知識を必要とする免疫学的研究のための貴重なツールです。ここでは、ラットにおける異所性心臓および心筋細胞移植のための実行可能なアプローチを提示する。私たちのモデルのすべての重要なステップを強調し、簡素化することによって、外科的背景を持たない研究者は、合理的な時間でこのモデルを習得できるはずです。
両方の移植モデルは、寛容と拒絶反応のメカニズムに貴重な洞察を提供し、様々な種に適用することができます。私たちは、事前の外科訓練なしで個人にこのモデルを教える多くの経験を持っています。重要なステップを学んだ後、私たちは、死んだ動物との忍耐と十分な練習をアドバイスします。
ドナー心臓排泄のために、7〜22週齢ラットドナー動物の麻酔でペダル反射への応答の欠如を確認した後、眼潤滑剤を塗布し、腹部および胸部の毛皮を除去するために機械的なバリカンを使用する。ラットを熱ベースの上のサイン位置に置き、手術テーブルの基部に弾性バンドで手足を固定します。70%エタノールで露出した皮膚を消毒し、中央値の腹腔内術を行う。
切開部にレトラクタを挿入し、殺菌綿棒を使用して腸をドナーの左側に動員し、下の大静脈を露出させる。次に、下の静脈を穿刺して、500の国際単位のヘパリンを1ミリリットルの氷冷同位塩基塩水溶液に溶解させた静脈注射を可能にする。綿棒を使用して軽い圧縮によって針の引き込み後に穿刺された部位で出血を止める。
横隔膜を切開し、ドナーの両側に側胸部切開術を行い、胸郭壁をピンで留める。2つのマイクロニードルホルダーを使用して鈍い調製によって心膜と迷走神経を取り除きます。排泄のために、腹部血管をトランセクトし、プローブ尖ったはさみの鈍い枝を横方向心膜のシヌスに挿入する。
心臓の軽い尾筋の牽引の下でできるだけ遠位に上昇大動脈および肺動脈を解剖するために圧縮を使用する。上方および下の大静脈と肺静脈の周りに単一の5-0合字を配置し、可能な限り後ろ向きに合字を段階的に締めます。合字に組織の後ろを切断し、心臓を抽出します。
植えられた心臓を浸透させるために、静脈内カテーテルから18ゲージカニューレを使用して、氷冷、同等張生理食塩水の30ミリリットルを洗浄し、上昇大動脈と肺動脈を通して1000国際単位のヘパリンを補った。ちょうど実証したように10〜14週齢のレシピエントラットを準備した後、レシピエントの左上側に腸を暖かく湿潤した圧縮に動員する。そして、手術顕微鏡または十分な代替手段を調整します。
十二指腸と近位性の全角を動員した後、それぞれ5〜7倍の完全な倍率を使用して、綿棒と鈍い解剖を使用して腹部大動脈および下大静脈を露出させる。腰部静脈を傷つけずに2つのマイクロ針ホルダーを使用して腹部を高め、クーリー血管クランプを血管に置きます。腹部の血管を穿刺するために30〜45度アーチ型27ゲージカニューレを使用してください。
そして、ポッツはさみを使用して、穿刺部位をドナー容器の内腔の大きさに一致する縦切開に拡大する。血栓を除去し、術後血栓症を防ぐために、生理的な血管を浸透させ、移植片を腹に置く。2つの単純な中断8-0を使用してモノフィラメント非再ソーブル縫合糸は、ドナー上昇大動脈を、縦切開の頭蓋および尾口角でレシピエント腹部大動脈に固定する。
レシピエントの腹部大動脈を持つドナーの上昇大動脈を吻合するには、8-0を実行して吻合の前半を行いながら、レシピエント血管の右側に移植片を置くモノフィラメント縫合。次に、移植片をレシピエント血管の左側に置き、吻着の後半を行う。ドナー肺動脈を下脳静脈に、頭蓋と尾角の2つの角の結び目と同様の方法で固定します。
各コーナーでドナー容器を結び目で固定した後、外側から容器の内側にステッチを置き、吻合の前半に対して内アルミナル吻合を実行します。縫合糸を結ぶ前に、内側から外側に別のステッチを置きます。吻合の後半を終えた後に末梢塞栓症を防ぐために、吻合の後半の結び目を締める前に、生理症を生理的に洗い流します。
両方のアナストモーゼの周りに止血性ガーゼを置き、慎重にグラフト再灌流を可能にするためにクーリー血管クランプを解放します。軽い圧縮および殺菌された綿棒の出血を管理する。約60秒後、心臓は鼓動を開始する必要があります。
慎重に腸を交換し、別の連続した3-0ポリフィラメントを実行縫合線で腹部筋膜と皮膚を閉じます。適切な実験時点で、示されているようにドナーラットの心臓を収穫し、無菌メスまたは無菌はさみを使用して心臓を3ミリメートルの断片で3つに細断する。コラゲターゼ1ミリリットル当たり0.5ミリグラムのコラゲターゼを37°Cで30分間補った20ミリリットルの培養培地で、30分消化します。
消化の終わりに、培養培地を取り除きながら、大きな毛穴のふるいに組織を加える。5~10ミリリットルの等張生理食塩水を加え、ふるいを通して組織スラリーをひずみます。そして、細胞懸濁液を2回遠心した後、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してそれを濾過する。
5~10ミリリットルの等張生理食塩水でストレーナーをすすいで、残りの細胞を採取します。そして遠心分離後、1ミリリットル当たり5倍の5細胞の濃度で生理食塩水中の単離されたラット心臓細胞を再懸濁する。細胞溶液を1ミリリットルのシリンジに積み込み、麻酔を受けたレシピエント動物をターゲットの耳を上に向けた横位置に置きます。
指と両面テープで耳を固定し、27ゲージカニューレを使用して、視覚毛細血管に近い20マイクロリットルの心筋細胞溶液をレシピエントの耳に皮下注入します。適切な実験観察期間の後、排液性子宮頸部リンパ節を抽出し、目的の適切な下流分析を行う。シンジェニック移植は、移植片の故障の兆候なしに最大100日間生存した。
特定のドナーとレシピエントの組み合わせは、異所性心臓移植拒絶反応の異なる速度をもたらす可能性があります。拒絶された心臓のクライオスタットセクションは免疫エフェクター細胞の浸潤の増加を明らかにするが、シンジェニック移植片は免疫細胞をほとんど含まない。心筋細胞注射後のリンパ節細胞の排液に関する子宮頸リンパ節切法および再刺激アッセイは、同種移植レシピエントにおける異所性心臓組織に対する特異的な菌株特異的免疫応答を明らかにし、サイトカインプロファイリングなどのさらなる免疫学的分析を保証する。
針を挿入して抽出する際は、容器を注意深く扱ってください。狭窄を防ぐために縫合糸にあまり注意を払わないでください。各吻合のためにあまりにも多くのステッチを配置しないでください。
