このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いて、生きている無傷の組織の文脈で細胞分裂のメカニズムを分析するために使用することができる。この技術の主な利点は、細胞の本来の生理学的環境が保存され、また、長時間のコース上でのライブイメージングを可能にすることです。この技術の最も重要な部分は、解剖または取り付け中に精巣が破損していないことを確認することです。
これは少しの時間と練習で習得されるスキルです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、精巣を同定して隔離する方法と、組織を損傷することなくイメージングのためにそれらを取り付ける方法を示すため、非常に重要です。原稿に記載されている動物、道具、メディアを準備する。
解剖を開始する前に、メディア充填フィルタシリンジを使用して、ガラススライドの上部、中央、底部に50マイクロリットルのメディアを3滴ずつ排出します。解剖プローブを使用して、5〜10分の10のインスター幼虫または早期の子犬をスライド上のメディアのトップドロップに移します。解剖プローブでメディアの幼虫と子犬を軽く攪拌し、食べ物や破片を取り除きます。
解剖プローブを使用して、単一の幼虫または子犬を横に回します。体の後部3分の1に半透明の楕円形の構造として現れる2つの両側精巣を探してください。精巣を欠いている動物はメスであり、捨てるべきです。
雄の幼虫や子犬が見つかり、清潔になったら、メディアの2番目のドロップに移動します。3、4匹の雄の幼虫または子犬がメディアの2番目の滴に移されるまで繰り返します。その後、メディアの2番目のドロップで作業し、その中間領域で鉗子のペアで単一の動物をつかみ、精巣の前にだけ。
2番目の鉗子を使用して、動物を半分に優しく引き裂きます。鉗子のペアを使用して、ガラススライド上の動物の後端を押し下げます。鉗子のすぐ隣から、メスの端を使用してキューティクルを押し下げます。
メスを動物のカットエンドに向かって動かします。これは、腸、脂肪体、精巣を含む動物の内臓を追放します。精巣は、脂肪体のリボンに埋め込まれた無色で、ほぼ透明な楕円形の器官です。
精巣を残りの器官からそっといじめる。精巣を一度に1つずつ転写するには、メスの縁を脂肪の下に挿入し、組織を培地から持ち上げ、3番目のドロップに素早く移動します。メスで組織を持ち上げるのに精巣にまだ十分な脂肪体が付着していない場合は、解剖媒体で予水したガラスパスツールピペットを使用する。
ミディアムの3番目のドロップで作業し、メスの鋭い端を使用して精巣から余分な脂肪体を優しくスライスし、エッジの周りに脂肪体の小さな縁を残します。まず、フィルターシリンジを使用して、シュナイダーの培地の1滴を約30マイクロリットルを50ミリメートルのガス透過培養皿の中央に堆積させます。メスツールまたはあらかじめ濡れたパスツールピペットを使用して、準備された精巣の5つまで皿のドロップに移します。
次に、メスツールを使用して、精巣をガス透過膜に静かに押し下げ、媒体の滴の中心に押し込みます。1ミリリットルのシリンジを使用して、培地の滴を取り囲むガス透過性膜に4滴のハロカーボン油を置きます。滴の位置は22ミリメートル級のカバースリップの四隅に対応する必要があります。
その後、22ミリメートルのガラスカバースリップの角を4滴のハロカーボンオイルに合わせ、カバースリップをメディアとオイルにそっと下げます。カバースリップが落ち着くようにし、精巣を含む媒体のために油の滴の間に広がりを。培養皿を解剖顕微鏡の下に置きます。
余分なメディアを取り除くために、カバースリップの下に繊細なタスクワイプの角を挿入します。ガラスカバースリップが最大の精巣の表面に接触するのに十分なメディアを離れてウィック。メディアを取り外しすぎてカバースリップを下げすぎないようにしてください。
これは精巣に圧力をかけ、破裂する可能性があります。最後に、精巣のすぐ上のガラスカバースリップに浸漬油を一滴置きます。皿をひっくり返し、顕微鏡のステージに置きます。
40または60 Xの顕微鏡の目的を精巣のすぐ下になるまでオイルに移します。透過光を使用して単一の精巣を見つけ、焦点を当てます。9つのよく解剖皿の1つの井戸にPBSTxで8%パラホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを置きます。
ガラスのパスツールピペットを使用して、最大10個の精巣を井戸に移します。精巣が井戸の底に横たわっていることを確認します。20分後、精巣を0.5ミリリットルのPBSTxを含むウェルに移します。
5分間やさしく攪拌して精巣を洗います。新しいPBSTxで新しい井戸でさらに2回洗浄します。原稿に記載されているように、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに一次抗体の希釈を準備します。
その後、9つのウェルガラス解剖皿からチューブに精巣を移します。穏やかなロッキングまたはヌツェーションで摂氏4度で一晩チューブをインキュベートします。二次抗体で精巣を染色する手順は同様である。
詳細は原稿を参照してください。まず、パスツールピペットを使用して、9つのウェルプレートからガラス顕微鏡スライドに精巣を移します。必要に応じて、メスのエッジを使用して、精巣をスライドの表面に押し下げます。
次に、精巣から余分な液体を吸い取るために繊細なタスクワイプのコーナーを使用します。できるだけ多くの液体を取り除きます。次いで、30~50マイクロリットルの顕微鏡実装媒体を精巣に塗布します。
最後に、22ミリのカバースリップを取り付け媒体の落下に置きます。カバースリップが落ち着き、取り付け媒体がカバースリップの下に広がります。必要に応じて、カバースリップに穏やかな圧力をかけて余分な取り付け媒体を絞り出し、カバースリップを精巣の表面に置きます。
このプロトコルが正常に実行されると、精巣の細胞組織が保存され、精巣の一方の端から他方の端への細胞分化の進行が見える。精子細胞は、起こす間に起きようとしているが、転移性の細胞を同定することができる。このプロトコルを用いて調製された精巣において、ライブイメージング分析は、精子細胞を分割する際の小胞子および微小細管の動的再編成を示す。
プロトコルで説明されているように、精巣が破裂する原因となる圧力を加えないように細心の注意を払う必要があります。精子細胞の嚢胞は破裂した精巣から急速に流出し、ライブタイムラプスイメージングが困難になる。このプロトコルは、生きている、無傷の組織で精子を分割するイメージングに最適化されています。
したがって、解剖や取り付け時に精巣が破損しないことが不可欠です。我々の方法は、構造化された照明顕微鏡などの超解像度イメージング技術にも適し、細胞分裂を支配する動的なサブセルラープロセスに関する新しい洞察を提供する必要があります。
