يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل آليات انقسام الخلايا في سياق المعيشة، والأنسجة سليمة باستخدام المجهر المفلور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يتم الحفاظ على البيئات الفسيولوجية الأصلية للخلايا ، مع السماح أيضًا بالتصوير المباشر على مدار دورات زمنية طويلة. أهم جزء من هذه التقنية هو التأكد من أن الخصيتان لا تتلف أثناء التشريح أو التركيب.
هذه هي المهارة التي يتم اكتسابها مع القليل من الوقت والممارسة. إن العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، لأنه يوضح كيفية تحديد الخصيين وعزلهما، وكيفية تركيبهما للتصوير دون إتلاف الأنسجة. إعداد الحيوانات والأدوات ووسائل الإعلام كما هو موضح في المخطوطة.
قبل البدء في تشريح، واستخدام وسائل الإعلام شغل حقنة مرشح لطرد ثلاث قطرات من وسائل الإعلام كل 50 ميكرولترات في أعلى، وسط، وأسفل من شريحة زجاجية. باستخدام مسبار تشريح، نقل خمسة إلى 10 ثالث اليرقات نجمة أو pupae في وقت مبكر إلى أعلى قطرة من وسائل الإعلام على الشريحة. يهيج بلطف اليرقات والضجر في وسائل الإعلام مع مسبار تشريح لإزالة أي طعام أو حطام.
استخدم المجس المتشريح لتحويل يرقات أو خادرة واحدة على جانبها. ابحث عن الخصيتين الثنائيتين التي تظهر كهياكل بيضاوية شفافة على الثلث الخلفي من الجسم. الحيوانات التي تفتقر إلى الخصيتان هي أنثى، وينبغي التخلص منها.
عندما يتم العثور على يرقات الذكور أو الخواد ونظيفة ، نقله إلى قطرة ثانية من وسائل الإعلام. كرر حتى يتم نقل ثلاثة أو أربعة يرقات ذكورية أو خادرة إلى القطرة الثانية من الوسائط. ثم العمل في قطرة الثانية من وسائل الإعلام، فهم واحد مع زوج من ملقط في منتصف المنطقة، فقط في الجزء الأمامي من الخصيات.
استخدام زوج الثاني من ملقط لتمزيق بلطف الحيوان في النصف. باستخدام زوج من ملقط، عقد الطرف الخلفي من الحيوان إلى أسفل على الشريحة الزجاجية. بدءا من مجرد بجوار ملقط، ودفع إلى أسفل على بشرة باستخدام حافة مشرط.
تحريك مشرط نحو نهاية قطع من الحيوان. هذا سوف يطرد الأعضاء الداخلية للحيوان، والتي تشمل الشجاعة، والهيئات الدهنية، والخصيتين. الخصيتان عديمتان اللون وشفافية تقريباً أعضاء بيضاوية مدمجة في شرائط من الجسم الدهني.
ندف بلطف بعيدا الخصيات من بقية الأعضاء. لنقل الخصيات واحدة في وقت واحد، أدخل حافة المشرط تحت الجسم الدهون، ورفع الأنسجة من وسائل الإعلام، ونقلها بسرعة إلى قطرة الثالثة. إذا لم يكن هناك ما يكفي من الجسم الدهون لا تزال تعلق على الخصيتين لرفع الأنسجة مع مشرط استخدام ماصة باستور الزجاج الذي تم prewetted مع المتوسطة تشريح.
العمل في قطرة ثالثة من المتوسطة، واستخدام نهاية حادة من مشرط لشريحة بلطف بعيدا الجسم الدهون الزائدة من الخصيات، وترك مجرد حافة صغيرة من الجسم الدهون حول حواف. أولاً، استخدم حقنة الفلتر لإيداع قطرة واحدة من متوسط شنايدر حوالي 30 ميكرولتر على مركز طبق ثقافة قابل للنفاذ من الغاز 50 ملليمتر. باستخدام أداة مشرط أو ماصة باستور prewetted نقل ما يصل إلى خمسة من الخصيتين المعدة إلى قطرة على الطبق.
بعد ذلك ، استخدم أداة المشرط لدفع الخصيات بلطف إلى الغشاء نفاذي الغاز ، وإلى مركز قطرة المتوسطة. باستخدام حقنة ملليلتر واحدة، ضع أربع قطرات من زيت الهالوكربون على غشاء نفاذي للغاز المحيط بقطة الوسط. وينبغي أن مواقع قطرات تتوافق مع الزوايا الأربعة من 22 ملليمتر من الدرجة coverslip.
ثم محاذاة زوايا 22 ملليمتر الزجاج الأغطية مع أربع قطرات من زيت الهالوكربون وبلطف خفض الغطاء على وسائل الإعلام والنفط. السماح لل coverlip لتسوية، وبالنسبة لوسائل الإعلام التي تحتوي على الخصيتين انتشار بين قطرات من النفط. ضع طبق الثقافة تحت مجهر تشريح.
لإزالة الوسائط الزائدة، قم بإدراج زاوية مسح مهمة حساسة أسفل غطاء الأغطية. ويك بعيدا ما يكفي من وسائل الإعلام لالأغطية الزجاج لمجرد إجراء اتصال مع سطح أكبر الخصية. لا تقم بإزالة الكثير من الوسائط وخفض الغطاء بعيدا جدا.
وهذا سوف يمارس الضغط على الخصيات، وقد يسبب لهم تمزق. وأخيرا، ضع قطرة من زيت الغمر على غطاء الزجاج فوق الخصية. تسليم الطبق، ووضعها على مرحلة المجهر.
نقل الهدف 40 أو 60 X المجهر في النفط حتى يكون أقل بقليل من الخصية. استخدام الضوء المنقولة للعثور على الخصية واحدة وإحضارها في التركيز. مكان 0.5 ملليلتر من 8٪ شبهformaldehyde في PBSTx في بئر واحد من تسعة صحن تشريح جيدا.
استخدم ماصة باستور الزجاجية لنقل ما يصل إلى 10 من الخصيات إلى البئر. تأكد من أن الخصيتان مستلقيتان على الجزء السفلي من البئر. بعد 20 دقيقة، نقل الخصيتين إلى بئر يحتوي على 0.5 ملليلتر من PBSTx.
غسل الخصيتين عن طريق التحريض بلطف لمدة خمس دقائق. اغسل مرتين في آبار جديدة مع PBSTx الطازجة.
ثم نقل الخصيات من تسعة بئر الزجاج تشريح الطبق إلى الأنبوب. احتضان الأنبوب بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف أو nutation. الإجراء تلطيخ الخصيات مع الأجسام المضادة الثانوية مماثلة.
انظر المخطوطة لمزيد من التفاصيل. أولاً، باستخدام ماصة باستور، قم بنقل الخصيات من لوحة الآبار التسعة إلى شريحة مجهرية زجاجية. إذا لزم الأمر، استخدم حافة المشرط لدفع الخصيات إلى أسفل على سطح الشريحة.
المقبل، واستخدام زاوية من مهمة حساسة مسح لإبْكة السائل الزائد بعيداً عن الخصية. إزالة السائل قدر الإمكان. ثم تطبيق 30 إلى 50 قطرات ميكرولتر من المجهر تصاعد المتوسطة إلى الخصيات.
وأخيرا، ضع غطاء 22 ملليمتر على قطرة متوسطة التركيب. السماح لل coverlip لتسوية، والمتوسطة تصاعد للانتشار تحت غطاء. إذا لزم الأمر، وتطبيق ضغط لطيف على غطاء للضغط على زيادة المتوسطة تصاعد والسماح للأغطية للراحة على سطح الخصية.
عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، يتم الاحتفاظ بالتنظيم الخلوي للخصيات، وتدرج تمايز الخلية من نهاية واحدة من الخصية إلى الأخرى مرئياً. يمكن تحديد الحيوانات المنوية على وشك البدء في الداء الوسيم وتلك الموجودة في ميتافاتايز. في الخصيات المعدة باستخدام هذا البروتوكول، يظهر تحليل التصوير الحي إعادة التنظيم الديناميكي للرطب endoplasmic وبيبات صغيرة في تقسيم الحيوانات المنوية.
كما هو موضح في البروتوكول، يجب توخي الحذر الشديد لعدم ممارسة الضغط الذي يسبب الخصيتان لتنفجر. تتدفق الخراجات من الخلايا المنوية بسرعة من الخصية الممزقة ، مما يجعل التصوير الحي لفاصل الوقت صعبًا. هذا البروتوكول هو الأمثل للتصوير تقسيم الخلايا المنوية في الأنسجة الحية، سليمة.
ولذلك، فمن الضروري أن لا تتلف الخصيتان أثناء التشريح أو التركيب. يجب أن تكون طريقتنا مناسبة أيضًا لتقنيات التصوير فائقة الدقة ، مثل المجهر المُنظم للإضاءة ، مما يوفر رؤى جديدة في العمليات الخلوية الفرعية الديناميكية التي تحكم انقسام الخلايا.
