Bu protokol, floresan mikroskopi kullanılarak canlı, bozulmamış doku bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarıanaliz etmek için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin doğal fizyolojik ortamlarının korunması ve aynı zamanda uzun süreli kurslar da canlı görüntülemeye olanak sağlamasıdır. Bu tekniğin en önemli parçası, testislerin diseksiyon veya montaj sırasında zarar görmemesini sağlamaktır.
Bu zaman ve uygulama biraz elde edilen bir beceridir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü testislerin nasıl tanımlanıp izole edilebildiğini ve dokuya zarar vermeden görüntüleme için nasıl monte edilebildiğini gösterir. El yazmasında açıklandığı gibi hayvanları, araçları ve medyayı hazırlayın.
Diseksiyonu başlamadan önce, cam bir kaydıraktan her biri 50 mikrolitre lik üç damla medya çıkarmak için ortam dolu filtre şırıngasını kullanın. Bir diseksiyon sondası kullanarak, beş ila 10 üçüncü instar larvaları veya erken pupa slayt üzerinde medya üst damla aktarın. Hafifçe herhangi bir gıda veya enkaz kaldırmak için diseksiyon sondası ile medyada larva ve pupa çalkalayın.
Tek bir larva veya pupa yan açmak için diseksiyon sondası kullanın. Vücudun arka üçüncü yarı saydam oval yapılar olarak görünen iki çift taraflı testisler arayın. Testisleri olmayan hayvanlar dişidir ve atılmalıdır.
Bir erkek larva veya pupa bulunduğunda ve temiz olduğunda, medyanın ikinci damlasına taşıyın. Üç veya dört erkek larva veya pupa medyanın ikinci damlasına aktarılana kadar tekrarlayın. Sonra medyanın ikinci damlasında çalışırken, orta bölgesinde bir çift forceps ile tek bir hayvan kavramak, sadece testisler için ön.
Hayvanı yavaşça ikiye ayırmak için ikinci bir çift forceps kullanın. Bir çift forceps kullanarak, cam slayt üzerinde hayvanın arka ucunu basılı tutun. Forceps hemen yanında başlayarak, neşter kenarını kullanarak mite aşağı itin.
Neşteri hayvanın kesilen ucuna doğru hareket ettirin. Bu bağırsaklar, yağ organları ve testisler dahil hayvanın iç organları, dışarı atacaktır. Testisler renksiz ve neredeyse şeffaf oval organlar yağ vücut şeritler gömülü.
Testisleri diğer organlardan ayırın. Testisleri teker teker aktarmak için, neşterin kenarını yağ gövdesinin altına yerleştirin, dokuyu ortamdan kaldırın ve hızlı bir şekilde üçüncü damlaya taşıyın. Yeterli yağ vücut hala neşter ile doku kaldırmak için testisler bağlı değilse diseksiyon orta ile önceden aşınmış olan bir cam Pasteur pipet kullanın.
Orta üçüncü damla çalışma, yavaşça testislerden aşırı yağ vücut dilim lemek için neşter keskin ucunu kullanın, kenarlarında yağ vücut sadece küçük bir jant bırakarak. İlk olarak, 50 milimetrelik gaz geçirilebilir kültür çanak merkezine Yaklaşık 30 mikrolitre Schneider orta tek bir damla yatırmak için filtre şırınga kullanın. Neşter aracını veya önceden ıslanmış pasteur pipetini kullanarak hazırlanan testislerden beşine kadar çanak taki damlasına aktarılır.
Daha sonra, testisleri gaz geçirilebilir membranın üzerine ve orta daki damlanın ortasına yavaşça itmek için neşter aracını kullanın. Bir mililitrelik şırınga kullanarak, orta damla çevreleyen gaz geçirilebilir membran üzerinde halokarbon yağı dört damla yerleştirin. Damlaların yerleri 22 milimetrelik bir kapak fişinin dört köşesine karşılık gelir.
Daha sonra 22 milimetrelik cam kapak lı bir kapağın köşelerini dört damla halokarbon yağıyla hizalayın ve coverslip'i hafifçe ortama ve yağa indirin. Coverslip yerleşmek için izin verin ve testisler içeren medya için yağ damlaları arasında yayıldı. Kültür çanasını bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.
Fazla ortamı kaldırmak için, kapak altına hassas bir görev silme nin köşesini takın. Sadece en büyük testis yüzeyi ile temas yapmak için cam coverslip için yeterli medya wick uzakta. Çok fazla ortam çıkarmayın ve kapak kaymasını çok fazla düşürün.
Bu testisler üzerinde baskı uygulayacak ve onları yırtılma neden olabilir. Son olarak, testislerin hemen üzerinde cam kapak üzerine daldırma yağı bir damla yerleştirin. Tabağı ters çevirin ve mikroskop aşamasına yerleştirin.
Testislerin hemen altında olana kadar 40 veya 60 X mikroskop hedefini yağa taşıyın. Tek bir testis bulmak ve odak haline getirmek için iletilen ışığı kullanın. PBSTx'te 0,5 mililitre %8 paraformaldehiti dokuz iyi diseksiyon kabının bir kuyusu içinde yerleştirin.
Testislerden 10'a kadarını kuyuya aktarmak için cam bir Pasteur pipeti kullanın. Testislerin kuyunun dibinde olduğundan emin olun. 20 dakika sonra testisleri 0,5 mililitre PBSTx içeren bir kuyuya aktarın.
Beş dakika hafifçe çalkalayarak testisleri yıkayın. Taze PBSTx ile yeni kuyularda iki kez daha yıkayın. El yazmasında açıklandığı gibi 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde birincil antikor seyreltme hazırlayın.
Daha sonra testisleri dokuz kuyu cam kesme çanaktan tüpe aktarın. Tüp gece boyunca dört santigrat derecede hafif sallanma veya fındık ile tüp kuluçka. Testislerin ikincil antikorla boyanma prosedürü benzerdir.
Ayrıntılar için el yazmasına bakın. İlk olarak, pasteur pipetkullanarak, testisleri dokuz kuyu plakasından cam mikroskopi slaytına aktarın. Gerekirse, testisleri slayt yüzeyine itmek için neşterin kenarını kullanın.
Daha sonra, testislerden fazla sıvıyı uzaklaştırmak için hassas bir görev silme nin köşesini kullanın. Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın. Daha sonra testislere 30-50 mikrolitrelik mikroskoper montaj ortamı uygulayın.
Son olarak, montaj ortamının damlaüzerine 22 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin. Coverslip yerleşmek için izin ve montaj orta coverslip altında yaymak için. Gerekirse, fazla montaj ortamını sıkmak için kapak kaymasına hafif basınç uygulayın ve örtü kaymanın testislerin yüzeyinde dinlenmesine izin verin.
Bu protokol başarıyla yürütüldüğünde, testislerin hücresel organizasyonu korunur ve hücre farklılaşmasının testisin bir ucundan diğer ucuna ilerlemesi görünür. Meyozis ve metafazdaki spermatositler tespit edilebilir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan testislerde canlı görüntüleme analizi, spermatositlerin bölünmesinde endoplazmik retikulum ve mikro tübüllerin dinamik olarak yeniden yapılandırıcılığı göstermektedir.
Protokolde açıklandığı gibi, testislerin patlamasına neden olan basıncı uygulamamaya özen gerekir. Spermatosit kistleri yırtık bir testisten hızla dışarı akar ve bu da canlı zaman atlamalı görüntülemeyi zorlaştırır. Bu protokol, spermatositlerin canlı, bozulmamış dokuda bölünmesini görüntülemek için optimize edilebiyi optimize edemeye yöneliktir.
Bu nedenle, testislerin diseksiyon veya montaj sırasında zarar görmemesi esastır. Yöntemimiz aynı zamanda, hücre bölünmesini yöneten dinamik alt hücresel süreçlere yeni bakış açısı sağlayan yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gibi süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri için de uygun olmalıdır.
