Этот протокол может быть использован для анализа механизмов деления клеток в контексте живой, нетронутой ткани с помощью микроскопии флуоресценции. Основным преимуществом этой техники является то, что клетки родной физиологической среды сохраняются, а также позволяет живой визуализации в течение длительного времени курсов. Наиболее важной частью этого метода является обеспечение того, чтобы яички не повреждены во время вскрытия или монтажа.
Это навык, который приобретается с немного времени и практики. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку он показывает, как определить и изолировать яички, и как смонтировать их для визуализации, не повреждая ткани. Подготовка животных, инструментов и средств массовой информации, как описано в рукописи.
Перед началом вскрытия используйте заполненный средствами массовой информации фильтрный шприц, чтобы изгнать три капли мультимедиа каждые 50 микролитров в верхней, средней и нижней части стеклянной горки. Используя рассечение зонда, перенесите от 5 до 10 третьих личинок instar или ранних куколок в верхнюю каплю мультимедиа на слайде. Аккуратно агитировать личинок и куколок в средствах массовой информации с рассечения зонда, чтобы удалить любую пищу или мусор.
Используйте рассечение зонда, чтобы превратить одну личинку или куколки на его стороне. Ищите два двусторонних яичка, которые появляются как полупрозрачные овальные структуры на задней трети тела. У животных, у которых нет яий, есть самки, и они должны быть выброшены.
Когда мужские личинки или куколки найдены и чисты, переместите их на вторую каплю мультимедиа. Повторяйте до тех пор, пока три или четыре самца личинок или куколок не будут перенесены на вторую каплю мультимедиа. Затем, работая во второй капле средств массовой информации, схватить одно животное с парой типсов в его середине региона, только перед яичками.
Используйте вторую пару типсов, чтобы аккуратно разорвать животное пополам. Используя пару типсов, удерживайте задний конец животного на стеклянной горке. Начиная только рядом с типсами, нажмите вниз на кутикулу, используя край скальпеля.
Перемести скальпель к концу разреза животного. Это изгоняет внутренние органы животного, которые включают кишки, жировые тела и яички. Яички бесцветные и почти прозрачные овальные органы, встроенные в ленты толстого тела.
Аккуратно дразнить друг от друга яички от остальных органов. Чтобы перенести яички по одному, вставьте край скальпеля под толстое тело, поднимите ткань из мультимедиа и быстро перемести ее на третью каплю. Если не хватает жира тела по-прежнему прилагается к яичкам, чтобы поднять ткани скальпелем использовать стеклянный пастер пипетку, которая была prewetted с вскрытием среды.
Работая в третьей капле среды, используйте острый конец скальпеля, чтобы аккуратно отрезать лишнее жировое тело от яитесов, оставляя только небольшой край жира тела по краям. Во-первых, используйте фильтр шприц для депонировать одну каплю среды Шнайдера около 30 микролитров на центр 50-миллиметрового газа проницаемой культуры блюдо. Использование скальпеля инструмент или prewetted Пастер пипетка передачи до пяти подготовленных испытаний на падение на блюдо.
Далее используйте скальпель инструмент, чтобы мягко нажать яички вниз на газ проницаемой мембраны, и в центре капли среды. Используя один миллилитровый шприц, поместите четыре капли галоуглеродного масла на газоспособную мембрану, окружающую каплю среды. Расположение капель должно соответствовать четырем углам крышки 22-миллиметрового класса.
Затем выровняйте углы 22-миллиметровой стеклянной крышки с четырьмя каплями галоуглеродного масла и аккуратно опустите крышку на медиа и масло. Разрешить крышку, чтобы урегулировать, и для средств массовой информации, содержащих яички распространения между каплями масла. Поместите блюдо культуры под рассечение микроскопа.
Чтобы удалить излишки мультимедиа, вставьте угол деликатной задачи протрите под крышкой. Wick от достаточно средств массовой информации для стеклянной крышкой, чтобы просто установить контакт с поверхностью крупнейших яичка. Не удалять слишком много мультимедиа и опустить крышки слишком далеко.
Это будет оказывать давление на яички и может привести к их разрыву. Наконец, поместите каплю масла погружения на стеклянную крышку чуть выше яижек. Переверни блюдо и поместите его на сцену микроскопа.
Переместите цель микроскопа 40 или 60 X в масло, пока оно не будет чуть ниже яитесов. Используйте передаваемый свет, чтобы найти один яичк и привести его в фокус. Поместите 0,5 миллилитров 8%paraformaldehyde в PBSTx в один колодец из девяти хорошо рассекает блюдо.
Используйте стеклянную пипету Pasteur для переноса до 10 яитесов в колодец. Убедитесь, что яички лежат на дне колодец. Через 20 минут перенесите яички в колодец, содержащий 0,5 миллилитров PBSTx.
Вымойте яички, агитирует осторожно в течение пяти минут. Вымойте еще два раза в новых скважинах со свежим PBSTx. Подготовка разбавления первичного антитела в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки, как описано в рукописи.
Затем перенесите яички из девяти хорошо стекла рассечения блюдо в трубку. Инкубировать трубку на ночь при четырех градусах по Цельсию с нежным качания или гайки. Процедура окрашивания яитесов вторичным антителом аналогична.
Подробности смотрите в рукописи. Во-первых, используя пипетку Pasteur, перенесите яички из девяти хорошо пластины на стеклянную микроскопию слайд. При необходимости используйте край скальпеля, чтобы спустить яички на поверхность слайда.
Далее используйте угол деликатной задачи протрите, чтобы фитиль от избыточной жидкости из яитесов. Удалите как можно больше жидкости. Затем нанесите на яички 30-50 микролитровую каплю микроскопии.
Наконец, поместите 22-миллиметровую крышку на каплю монтажной среды. Разрешить coverslip урегулировать, и монтаж среды для распространения под крышкой. При необходимости нанесите мягкое давление на крышку, чтобы выжать излишки монтажной среды и позволить крышке отдохнуть на поверхности яижек.
Когда этот протокол успешно выполняется, клеточная организация яисков сохраняется, и прогрессирование дифференциации клеток от одного конца яичка к другому видно. Сперматомоциты вот-вот начнется мейоз и те, в метафазе могут быть определены. В яичках, подготовленных с помощью этого протокола, живой анализ изображений показывает динамическую реорганизацию эндоплазмической стикулум и микротюбулы в делении сперматозоидов.
Как описано в протоколе, необходимо позаботиться о том, чтобы не оказывать давления, которое приводит к взрыву яивок. Кисты сперматозоидов быстро вытекают из разорванного яичка, что затрудняет визуализацию промежуток времени в реальном времени. Этот протокол оптимизирован для визуализации, разделяющей сперматозоиды в живых, нетронутых тканях.
Поэтому важно, чтобы яички не повреждаются во время вскрытия или монтажа. Наш метод также должен подходить для методов визуализации супер разрешения, таких как структурированная микроскопия освещения, обеспечивая новое понимание динамических субклеточных процессов, которые регулируют деление клеток.
