ヒトマクロファージ生物学の研究は、ドナーから細胞を収集することに依存しているため、限られています。このプロトコルは、多能性幹細胞からヒトマクロファージを製造できる方法を示しています。これは、細胞療法や研究のために大量にマクロファージを生成するためにスケールアップすることができる堅牢なプロトコルです。
多能性幹細胞は遺伝的に操作することができる。したがって、このプロトコルでは、特定の表現型、蛍光タグ、およびマクロファージを用いて、疾患状態をモデル化するマクロファージを生成することができます。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、簡単な通路ツールの使用は多くの研究者にとって馴染みがないため、便利です。
また、培地を補充し、細胞を収穫する際に必要なケアのレベルは、言葉にするのは難しいです。培養細胞が80%合流に達したら、使用済み培地を1.5ミリリットルの新鮮培地に置き換えます。培養容器を片手に持ち、使い捨てセル通過ツールをプレートを横切って一方向に転がします。
ローラーのすべてのブレードがプレートに触れている必要があります。転がりながら均一な圧力を維持する。全体の井戸が覆われるまで、同じ方向に転がりを繰り返します。
培養容器を90度回転させて、繰り返し転がします。滅菌ピペットを使用して、切断されたコロニーを取り除くために井戸内の媒体を使用する。CELLstartを吸引し、メディアを置き換えます。
原稿に記載されているように調製されたプレコーティングされたウェルに1対4の比率で細胞を移す。ゼロ日目に分化プロセスを開始するには、ステージ1の培地2.25ミリリットルを超低添付着6ウェルプレートの2つの井戸に追加します。その後、6ウェルプレート内のiPSCの1つの80%コンフルエントウェルに対して、メンテナンスメディアを1.5ミリリットルのステージ1メディアに置き換えます。
新しいセル通過ツールを使用してコロニーをカットします。ピペットを使用して、切断されたコロニーを超低添付着6ウェルプレートの2つの井戸に移します。2日目に、2日目の胚体を含む6ウェルプレートに0.5ミリリットルのhESC SFM培地を添加してサイトカイン濃度を調整する。
4日目には、0.1%ゼラチンで6ウェル組織培養プレートの4つの井戸をコーティングします。少なくとも10分間インキュベートした後、ゼラチンを取り出し、2.5ミリリットルのステージ2培地を加える。6ウェルプレートの2つの井戸から形成された胚体を収集し、50ミリリットルの遠心分離管に入れる。
重力によってチューブの底に落ち着くようにします。その後、慎重にチューブから培地を吸引し、ステージ2培地の2ミリリットルで胚体を再中断する。10~15個の胚体を、2.5ミリリットルのステージ2培地を含むゼラチンコーティングウェルに移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。
2~3週間は、3~4日ごとにメディアを交換します。EBのめっきは非常に重要です。10 個未満または 15 個より多い EB を持つか、またはそれらを不均一に分散させることは、マクロファージの低収率につながることができます。
2~3週間後、胚体は非接着造血細胞を懸濁液に放出し始める。40マイクロメートルのストレーナーを使用して、これらの細胞を50ミリリットルのチューブに集め、次に培地を補充します。造血細胞の懸濁液を200回gで3分間遠心分離する。
ステージ3培地で造血細胞を再懸濁する。その後、ミリリットル当たり6番目の細胞に0.2倍の10倍の密度で細胞をプレートします。5 日ごとにステージ 3 メディアを変更します。
9~11日後、マクロファージは完全に分化され、完全に機能します。96ウェルプレートの各ウェルに、第4のiPSC由来マクロファージに8倍の10倍のステージ3メディアを加えます。iPSC由来マクロファージを含む各ウェルに100マイクロリットルのビーズ溶液を加えます。
高含有イメージングシステムを使用してプレートを画像化します。適切な表現を得るために、各ウェル全体で 3 つ以上のフィールドを取得します。iPSCコロニー、胚体、造血細胞、および成熟したマクロファージは形態学的に異なっていた。
iPSC由来マクロファージは大きく、単一の小さな楕円形の核を有し、多くの小胞を含む豊富な細胞質を有していた。マクロファージ表現型は、フローサイトメトリーにより評価した。成熟したiPSC由来マクロファージは、系統マーカーCD45とマクロファージ成熟マーカー25F9を発現し、単球未熟マクロファージマーカーCD93に対して陰性であった。
iPSC由来マクロファージは、数系統の骨髄系マーカーを発現し、免疫変調マーカーCD86に陽性であった。マクロファージのごく一部は、CX3CR1、CCR2、CCR5、およびCCR8のケモカイン受容体を発現した。iPSC-DM貪食能は、バイオ粒子と高含有イメージングシステムを用いて評価した。
マクロファージ培養物に添加すると生体粒子は非蛍光であったが、食細胞細胞内酸性pHでは蛍光体が明るい緑色に蛍光を発した。食細胞性分画は、生体粒子を貪食したマクロファージの割合を表し、食細胞指数は、各マクロファージが摂取した生体粒子数の尺度である。マクロファージは、環境の手掛かりに応じて表現型を変えることができます。
RT-PCRは、遺伝子のアップレギュレートmRNA発現を定量化するために使用された。LPSおよびインターフェロンγまたはIL4で処理されたマクロファージは、ナイーブマクロファージと比較して、貪食細胞の有意に低い割合を示した。IL10で処理したマクロファージは、貪食細胞の増加割合および貪食指数の増加を示した。
このプロトコルは、マクロファージが動物モデルで治療的であることが示されている慢性肝疾患などの疾患を治療するための細胞の既製の供給源を提供するために使用することができる。iPSC由来マクロファージは、いくつかの疾患状態に関連するマクロファージを研究するために使用することができる。例えば、乳がんの腫瘍に関連するマクロファージを研究するためにこれらの細胞を使用しています。
KLF1と呼ばれる単一の転写因子を用いた遺伝子プログラミングにより、iPSC由来マクロファージの表現型を改変しました。これにより、赤血球島マクロファージに見えるマクロファージを作り出し、赤血球の産生と成熟に関する洞察を提供してきました。
