인간 대식세포 생물학 연구는 기증자에게서 세포를 수집에 의존하기 때문에 제한되었습니다. 이 프로토콜은 실험실에서 다능성 줄기 세포에서 인간 대식세포를 생산할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이것은 세포 치료 또는 연구를 위한 대량으로 대식세포를 생성하기 위하여 확장될 수 있는 강력한 프로토콜입니다.
만능 줄기 세포는 유전적으로 조작될 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜에서는 특정 표현형, 형광 태그 및 대식세포로 대식세포를 생성하여 질병 상태를 모델링할 수 있습니다. 이 프로토콜의 시각적 데모는 쉬운 통로 도구를 사용하는 것이 많은 연구자에게 익숙하지 않기 때문에 유용합니다.
또한, 미디어를 보충하고 세포를 수확할 때 필요한 치료 수준은 말로 표현하기 어렵습니다. 배양 된 세포가 80 %의 합류에 도달하면 소비 된 배양 배지를 신선한 배지의 1.5 밀리리터로 대체하십시오. 배양 용기를 한 손에 들고 일회용 셀 패딩 도구를 한 방향으로 접시를 가로 질러 굴리라.
롤러의 모든 블레이드는 접시를 만져야합니다. 압연하는 동안 균일한 압력을 유지합니다. 전체 우물이 덮여 될 때까지 같은 방향으로 롤링을 반복합니다.
배양 용기를 90도 회전하고 롤링을 반복합니다. 멸균 파이펫을 사용하여 우물의 미디어를 사용하여 절단 된 식민지를 제거하십시오. 셀레스타트를 흡인하고 미디어를 교체합니다.
원고에 설명된 바와 같이 미리 코팅된 우물에 1 대 4 비율로 세포를 이송한다. 0일째에 차별화 과정을 시작하려면 스테이지 1 미디어의 2.25 밀리리터를 초저 부착 6웰 플레이트의 두 개의 우물에 추가합니다. 그런 다음 6웰 플레이트에 있는 iPSC의 80% 컨웰드의 경우 유지 보수 미디어를 1.5 밀리리터의 1.5 밀리리터로 교체하십시오.
새로운 세포 패싱 도구를 사용하여 식민지를 잘라. 파이펫을 사용하여 절단 된 콜로니를 초저 부착 6 웰 플레이트의 두 우물로 옮기. 둘째 날, 2일째 배아체를 함유한 6웰 플레이트에 hESC SFM 매체의 0.5 밀리리터를 첨가하여 사이토카인 농도를 조절한다.
4일째에는 6웰 조직 배양판 4개 웰을 0.1%젤라틴으로 코팅합니다. 적어도 10 분 동안 배양 한 후 젤라틴을 제거하고 2 단계 2 개의 미디어의 밀리리터를 추가하십시오. 6웰 플레이트의 두 우물에서 형성된 배아 체를 수집하고 50 밀리리터 원심분리관에 놓습니다.
중력으로 튜브 의 바닥에 정착 할 수 있습니다. 그런 다음 조심스럽게 튜브에서 미디어를 흡인하고 단계 2 매체의 두 밀리리터에서 배아 시체를 재중단합니다. 10~15개의 배아 체를 2단계 미디어 2.5 밀리리터를 함유한 젤라틴 코팅 우물로 옮기고 이산화탄소 5%를 섭씨 37도에서 배양한다.
2~3주 동안 3~4일마다 미디어를 변경합니다. EB의 도금은 매우 중요합니다. 10개 미만 또는 15개 이상의 EB를 보유하거나 고르지 않게 분산하면 대식세포 수율이 낮아질 수 있습니다.
2 ~ 3 주 후에, 배아 바디는 정지로 비 부착한 조혈 세포를 풀어 놓기 시작합니다. 40 마이크로미터 스트레이너를 사용하여 이러한 세포를 50 밀리리터 튜브로 수집한 다음 미디어를 보충합니다. 3 분 동안 200 배 g에서 조혈 세포의 현탁액을 원심 분리합니다.
3단계 미디어에서 조혈 세포를 다시 중단합니다. 그런 다음 밀리리터당 6세포에 0.2배 10배의 밀도로 세포를 플레이트한다. 5일마다 3개의 미디어를 변경합니다.
9~11일 후에는 대식세포가 완전히 차별화되고 완벽하게 기능하게 됩니다. 제4 iPSC 유래 대식세포에 8번 10번을 추가하여 96웰 플레이트의 각 웰에 스테이지 3 미디어의 200 마이크로리터에 넣습니다. iPSC 유래 대식세포가 들어 있는 각 웰에 100마이크로리터의 비드 솔루션을 추가합니다.
고함량 이미징 시스템을 사용하여 플레이트를 이미지화합니다. 각 웰에 걸쳐 세 개 이상의 필드를 획득하여 좋은 표현을 얻습니다. iPSC 식민지, 배아 몸, 조혈 현탁액 세포 및 성숙한 대식세포는 형태학적으로 구별되었다.
iPSC 유래 대식세포는 크고, 단일 작은 타원형 핵을 가지고 있으며, 많은 소포를 포함하는 풍부한 세포질을 가졌다. 대식세포 표현형은 혈류 세포측정에 의해 평가되었다. 성숙한 iPSC 유래 대식세포는 계보 마커 CD45 및 대식세포 성숙 마커(25F9)를 발현하고 단세포 미성숙 대식파지 마커 CD93에 대해 부정적이었다.
iPSC 유래 대식세포는 여러 계보 골수성 마커를 발현하고 면역 변조 마커 CD86에 대해 양성이었다. 대식세포의 작은 비율은 CX3CR1, CCR2, CCR5 및 CCR8을 발현시켰다. iPSC-DM 식세포 능력은 생체 입자 및 고함량 이미징 시스템을 사용하여 평가되었다.
바이오입자는 대식세포 배양에 첨가했을 때 불형성이었지만, 세포내 산성 pH에서 청색광을 형광한 후. 식세포 분획은 phagocytosed 바이오 입자와 phagocytic 인덱스가 각 대식세포가 섭취한 바이오 입자의 수의 척도인 대식세포의 비율을 나타낸다. 대식세포는 환경 단서에 대응하여 표현형을 변경할 수 있습니다.
RT-PCR은 유전자의 상과된 mRNA 발현을 정량화하기 위해 사용되었다. LPS 및 인터페론 감마 또는 IL4로 처리된 대식세포는 순진한 대식세포에 비해 식세포 세포의 현저히 낮은 비율을 보였다. IL10으로 치료된 대식세포는 식세포 세포의 증가된 비율과 증가된 식세포 지수를 보였다.
이 프로토콜은 대식세포가 동물 모델에서 치료되는 것으로 나타난 만성 간 질환과 같은 질병을 치료하기 위해 세포의 기성 선반 소스를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. iPSC 유래 대식세포는 여러 질병 상태와 관련된 대식세포를 연구하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 우리는 유방암에 있는 종양과 관련되었던 대식세포를 공부하기 위하여 이 세포를 이용합니다.
우리는 KLF1에게 불린 단 하나 전사 인자를 사용하여 유전 프로그래밍에 의하여 iPSC 파생 한 대식세포의 표현형을 수정했습니다. 이를 통해 우리는 적혈구의 생산과 성숙에 대한 통찰력을 제공했습니다.
