İnsan makrofaj biyolojisi araştırmaları, bağışçılardan hücre toplamaya dayandığı için sınırlandırılmıştır. Bu protokol, laboratuvarda pluripotent kök hücrelerden insan makrofajları üretebileceğimiz bir yöntem göstermektedir. Bu hücre tedavileri veya araştırma için büyük miktarlarda makrofajlar üretmek için ölçeklenebilir sağlam bir protokoldür.
Pluripotent kök hücreler genetik olarak manipüle edilebilir. Yani bu protokolde, belirli bir fenotip, floresan etiketler ve ayrıca hastalık durumlarını modellemek için makrofajlar üretebiliriz. Kolay geçiş aracının kullanımı birçok araştırmacıya tanıdık olmayacağından, bu protokolün görsel gösterimi yararlıdır.
Ayrıca, ortam ve hasat hücreleri doldurmak için gerekli bakım düzeyi kelimelere koymak zordur. Kültürlü hücreler %80 biraraya geldiğinde, harcanan kültür ortamını 1,5 mililitre taze ortamla değiştirin. Kültür damarını bir elinizle tutarak, tek kullanımlık bir hücre geçiş aracını tek bir yöne plaka nın üzerinde yuvarlayın.
Silindirdeki tüm bıçaklar tabağa dokunuyor olmalı. Yuvarlanırken tek tip basıncı koruyun. Tüm kuyu kaplanana kadar aynı yönde yuvarlanma tekrarlayın.
Kültür kabını 90 derece döndürün ve yuvarlanmaya devam edin. Steril bir pipet ile, kesilmiş koloniler çıkarmak için kuyuda medya kullanın. Cellstart'ı aspire edin ve ortamı değiştirin.
El yazmasında açıklandığı gibi önceden kaplanmış kuyulara hücreleri bir-dört oranında aktarın. Sıfır gün farklılaşma işlemine başlamak için, ultra düşük eki altı iyi plaka iki kuyu içine sahne bir medya 2,25 mililitre ekleyin. Daha sonra altı kuyulu bir plakadaki iPSC'lerin %80'lik bir kuyusu için, bakım ortamını 1,5 mililitre lik birinci aşama ortamla değiştirin.
Yeni bir hücre geçiş aracı kullanarak kolonileri kesin. Bir pipet kullanarak, kesilmiş kolonileri ultra düşük eki altı kuyunun iki kuyuya aktarın. İkinci gün, sitokin konsantrasyonlarını, iki embriyoid cismi içeren altı kuyulu plakaya 0,5 mililitre hESC SFM media ekleyerek ayarlayın.
Dördüncü gün, % 0.1 jelatin ile altı iyi doku kültür plakası dört kuyu kat. En az 10 dakika kuluçkaya yattıktan sonra jelatini çıkarın ve ikinci aşama ortamına 2,5 mililitre ekleyin. Altı kuyulu bir plakanın iki kuyudan oluşan embriyoid bedenleri toplayın ve bunları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
Onları yerçekimi ile tüp altında yerleşmek için izin verin. Daha sonra dikkatlice tüpten medya aspire ve evre iki medya iki mililitre embriyoid organları askıya. 10 ila 15 embriyoid bedeni 2,5 mililitre evre iki medya içeren jelatin kaplı bir kuyuya aktarın ve %5 karbondioksitle 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
2-3 hafta boyunca, her üç ila dört günde bir medyayı değiştirin. EB'lerin kaplaması çok önemlidir. 10'dan az veya 15'ten fazla EB'ye sahip olmak veya bunların eşit olmayan şekilde dağıtılması makrofajların düşük verime yol açabilir.
İki ila üç hafta sonra, embriyoid organlar süspansiyon içine nonadherent hematopoetik hücreleri serbest başlar. 40 mikrometrelik bir süzgeç kullanarak, bu hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe toplayın ve sonra ortamı yeniler. Hematopoetik hücrelerin 3 dakika boyunca 200 kez g olarak süspansiyonsantrifuge.
Evre üç ortamda hematopoetik hücreleri resuspend. Daha sonra mililitre başına altıncı hücrelere 0,2 kez 10 yoğunlukta hücreleri plaka. Her beş günde bir sahne üç medya değiştirin.
Dokuz ila 11 gün sonra makrofajlar tamamen farklılaşmış ve tamamen işlevsel olacaktır. 96 kuyulu bir plakanın her kuyusu için üçüncü aşama ortamının 200 mikrolitresine dördüncü iPSC kaynaklı makrofajlara sekiz kat 10 ekleyin. iPSC kaynaklı makrofajlar içeren her kuyuya 100 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin.
Plakayı görüntülemek için yüksek içerikli görüntüleme sistemi kullanın. İyi bir temsil elde etmek için her kuyuda üç veya daha fazla alan edinin. iPSC kolonileri, embriyoid cisimler, hematopoetik süspansiyon hücreleri ve olgun makrofajlar morfolojik olarak farklıydı.
iPSC kaynaklı makrofajlar büyüktü, tek küçük oval şekilli çekirdekleri vardı ve birçok vezikül içeren bol sitoplazmaya sahipti. Makrofaj fenotip akış sitometrisi ile değerlendirildi. Olgun iPSC kaynaklı makrofajlar soy belirteci CD45 ve makrofaj olgunlaşma marker 25F9 ifade ve monosit immature makrofaj marker CD93 için negatif.
iPSC kaynaklı makrofajlar çeşitli soy miyeloid belirteçleri ifade ve immün modülasyon marker CD86 için pozitif. Makrofajların küçük bir kısmı keokin reseptörlerini CX3CR1, CCR2, CCR5 ve CCR8'i ifade etti. iPSC-DM fagositik yeteneği biyopartiküller ve yüksek içerikli görüntüleme sistemi kullanılarak değerlendirildi.
Biyopartiküller makrofaj kültürlere eklendiğinde floresan değildi, ancak fagositoz dan sonra hücre içi asidik pH parlak yeşil floresan. Fagositik fraksiyon, fagositoz biyopartiküllerin ve fagositik indeksinin her makrofajın yutturdığı biyopartikül sayısının ölçüsü olduğu makrofajların oranını temsil eder. Makrofajlar çevresel ipuçlarına yanıt olarak fenotip değiştirebilirsiniz.
RT-PCR genlerin düzensiz mRNA ekspresyonunu ölçmek için kullanıldı. LPS ve interferon gama veya IL4 ile tedavi edilen makrofajlar, naif makrofajlara kıyasla fagositik hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir yüzdesini gösterdi. IL10 ile tedavi edilen makrofajlar fagositik hücrelerin artmış yüzdesini ve fagositik indeksin arttığını gösterdi.
Bu protokol, makrofajların hayvan modellerinde tedavi edici olduğu gösterilmiştir kronik karaciğer hastalığı gibi hastalıkların tedavisinde hücrelerin bir off-the-raf kaynağı sağlamak için kullanılabilir. iPSC kaynaklı makrofajlar çeşitli hastalık durumları ile ilişkili makrofajlar çalışma için kullanılabilir. Örneğin, meme kanseri tümörleri ile ilişkili makrofajlar çalışma için bu hücreleri kullanın.
KLF1 adı verilen tek bir transkripsiyon faktörü kullanarak genetik programlama ile iPSC kaynaklı makrofajların fenotipini değiştirdik. Bununla, eritroid ada makrofajlarına benzeyen makrofajlar ürettik ve kırmızı kan hücrelerinin üretimi ve olgunlaşması hakkında bilgi sağladık.
