Исследования биологии макрофагов человека были ограничены, поскольку он опирается на сбор клеток от доноров. Этот протокол показывает метод, в котором мы можем производить макрофаги человека из плюрипотентных стволовых клеток в лаборатории. Это надежный протокол, который может быть расширен для производства макрофагов в больших количествах для клеточной терапии или исследований.
Плюрипотентными стволовыми клетками можно генетически манипулировать. Таким образом, в этом протоколе мы можем генерировать макрофаги с определенным фенотипом, флуоресцентными тегами, а также макрофагами для моделирования состояний заболеваний. Визуальная демонстрация этого протокола полезна, потому что использование инструмента легкого прохода не будет знакомо многим исследователям.
Кроме того, уровень ухода, необходимый при пополнении средств массовой информации и уборки клеток трудно сказать словами. Когда культурные клетки достигли 80%-ного слияния, замените оттраченную культурную среду на 1,5 миллилитров свежей среды. Держа культурный сосуд в одной руке, свернуть одноразовый инструмент прохода ячейки через пластину в одном направлении.
Все лезвия в ролике должны касаться пластины. Поддерживайте равномерное давление во время прокатки. Повторите прокатки в том же направлении, пока весь колодец был покрыт.
Поверните культурное судно на 90 градусов и повторите прокатку. С стерильной пипеткой используйте средства массовой информации в колодец, чтобы выбить разрезанные колонии. Аспират CELLstart и заменить средства массовой информации.
Передача ячеек в соотношении один к четырем на предварительно покрытые колодцы, подготовленные, как описано в рукописи. Чтобы начать процесс дифференциации на нулевой день, добавьте 2,25 миллилитров средств первой ступени в две скважины сверхнизкой пластины крепления из шести скважин. Затем для одной 80%-ной колодец iPSCs в шести-хорошо пластины, заменить обслуживание средств массовой информации с 1,5 миллилитров первого этапа средств массовой информации.
Вырезать колоний с помощью нового инструмента прохода клеток. Используя пипетки, перенесите разрезанные колонии в две скважины сверхнизкой крепления шести колодцев. На второй день отрегулируйте концентрацию цитокинов, добавив 0,5 миллилитров средств массовой информации hESC SFM к шести-хорошо пластины, содержащей день два эмбриональных органов.
На четвертый день, пальто четыре колодца из шести хорошо ткани культуры пластины с 0,1%желатина. После инкубации, по крайней мере 10 минут, удалить желатин и добавить 2,5 миллилитров второй стадии средств массовой информации. Соберите сформированные эмбриональные тела из двух колодцев из шести скважин пластины и поместите их в 50 миллилитровую центрифугу трубки.
Позвольте им поселиться в нижней части трубки под действием силы тяжести. Затем тщательно аспирировать средства массовой информации из трубки и повторно эмбриональных органов в двух миллилитров второй стадии средств массовой информации. Перенесите от 10 до 15 эмбриональных тел в хорошо покрытый желатином, содержащий 2,5 миллилитров средств массовой информации второй стадии и инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом.
В течение двух-трех недель меняются средства массовой информации каждые три-четыре дня. Покрытие EBs имеет решающее значение. Наличие менее 10 или более 15 EB или их неравномерное распределение может привести к низкой урожайности макрофагов.
Через две-три недели эмбриональные тела начинают выпускать неадхенерентные гематопоэтические клетки в суспензию. Используя 40-метровый ситечко, соберите эти клетки в 50 миллилитровую трубку, а затем пополнить средства массовой информации. Центрифуза суспензии гематопоэтических клеток в 200 раз г в течение трех минут.
Переподходить гематопоэтические клетки в третий этап средств массовой информации. Затем пластины клеток при плотности 0,2 раза от 10 до шестой клетки на миллилитр. Изменение стадии три средства массовой информации каждые пять дней.
Через 9-11 дней макрофаги будут полностью дифференцированы и полностью функциональны. Добавьте восемь раз 10 к четвертому макрофагам, полученным iPSC, в 200 микролитров трех-х стадий мультимедиа к каждому колодец пластины из 96 колодец. Добавьте 100 микролитров шарикового раствора в каждую колодец, содержащий макрофаги, полученные iPSC.
Используйте систему изображений с высоким содержанием для изображения пластины. Приобрети три или более полей в каждой колодец, чтобы получить хорошее представление. колонии iPSC, эмбриональные тела, гематопоэтические суспензиотические суспензиочные клетки и зрелые макрофаги были морфологически различны.
Макрофаги, полученные из iPSC, были большими, имели одиночные небольшие ядра овальной формы и имели обильную цитоплазму, содержащую много пузырьков. Фенотип макрофагов оценивался по цитометрии потока. Зрелые макрофаги, полученные iPSC, выражали маркер линии CD45 и маркер созревания макрофага 25F9 и были отрицательными для моноцитов незрелых макрофагов маркера CD93.
макрофаги, полученные iPSC, выражали несколько миелоидных маркеров линии и были положительными для иммунного маркера модуляции CD86. Небольшая доля макрофагов выражается химиокиновых рецепторов CX3CR1, CCR2, CCR5 и CCR8. Фагоцитная способность iPSC-DM оценивалась с помощью биочастиц и системы визуализации с высоким содержанием.
Биочастицы были нефлуоресцентными при добавлении в макрофаг культур, но после фагоцитоза флуоресцентный ярко-зеленый во внутриклеточной кислой рН. Фагоцитатическая фракция представляет собой долю макрофагов, которые фагоцитозные биочастицы и фагоцитатический индекс является мерой количества биочастиц, что каждый макрофаг попадает. Макрофаги могут изменять фенотип в ответ на сигналы окружающей среды.
RT-PCR использовался для количественной оценки регулируемого экспрессии генов мРНК. Макрофаги, обработанные LPS и интерфероном гамма или IL4 показали значительно более низкий процент фагоцитных клеток по сравнению с наивными макрофагами. Макрофаги, обработанные IL10, показали повышенный процент фагоцитных клеток и повышенный фагоцитный индекс.
Этот протокол может быть использован для обеспечения готовый источник клеток для лечения таких заболеваний, как хронические заболевания печени, где макрофаги, как было показано, терапевтические в животных моделях. Макрофаги, полученные из iPSC, могут быть использованы для изучения макрофагов, связанных с несколькими состояниями болезни. Например, мы используем эти клетки для изучения макрофагов, связанных с опухолями при раке молочной железы.
Мы модифицировали фенотип макрофагов, полученных iPSC, с помощью генетического программирования, используя единый транскрипционный фактор под названием KLF1. При этом мы произвели макрофаги, которые выглядят как эритроидные островные макрофаги, и они дали представление о производстве и созревании эритроцитов.
