מחקר ביולוגיה מקרופאג אנושי הוגבל משום שהוא מסתמך על איסוף תאים מתורמים. פרוטוקול זה מראה שיטה שבה אנו יכולים לייצר מקרופאגים אנושיים מתאים גזע פלוריפוטנטיים במעבדה. זהו פרוטוקול חזק שניתן לשנות את קנה המידה שלו כדי לייצר מקרופאגים בכמויות גדולות עבור טיפולים בתאים או מחקר.
תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים להיות מניפולציה גנטית. אז בפרוטוקול זה, אנחנו יכולים ליצור מקרופאגים עם פנוטיפ ספציפי, תגי פלואורסצנט, וגם מקרופאגים כדי מודל מצבי מחלה. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה שימושית מכיוון שהשימוש בכלי המעבר הקל לא יהיה מוכר לחוקרים רבים.
כמו כן, קשה לתאר במילים את רמת הטיפול הדרושה בעת חידוש מלאי וקצירת תאים. כאשר התאים התרבותיים הגיעו ל-80%, החליפו את מדיום התרבות המושקע ב-1.5 מיליליטר של מדיום טרי. מחזיק את כלי התרבות ביד אחת, לגלגל כלי מעבר תא חד פעמי על פני הצלחת בכיוון אחד.
כל הלהבים בגלגלת בטח נוגעים בצלחת. לשמור על לחץ אחיד תוך כדי גלגול. חזור על גלגול באותו כיוון עד שהתקרה כולה תכסה.
לסובב את כלי התרבות 90 מעלות ולחזור על גלגול. עם פיפטה סטרילית, השתמש במדיה באר כדי לנתק מושבות חתוכים. שאף CELLstart והחלף מדיה.
מעבירים תאים ביחס של 1 ל-4 ל בארות מצופות מראש שהוכנו כמתואר בכתב היד. כדי להתחיל את תהליך הבידול ביום אפס, להוסיף 2.25 מיליליטר של מדיה שלב אחד לשתי בארות של קובץ מצורף נמוך במיוחד שישה בארות צלחת. לאחר מכן, עבור באר אחת של 80% של IPSCs בצלחת של שש בארות, החלף את מדיית התחזוקה ב-1.5 מיליליטר של מדיה בשלב הראשון.
גזור מושבות באמצעות כלי מעבר תא חדש. באמצעות פיפטה, להעביר את המושבות לחתוך לשתי בארות של צלחת שישה בארות מצורף נמוך במיוחד. ביום השני, להתאים את ריכוזי ציטוקינים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של hESC SFM מדיה לצלחת שש באר המכיל את היום שני גופים עובריים.
ביום הרביעי, מעיל ארבע בארות של צלחת תרבות רקמות שש בארות עם 0.1% ג'לטין. לאחר הדגירה לפחות 10 דקות, להסיר את הג'לטין ולהוסיף 2.5 מיליליטר של מדיה שלב שני. לאסוף גופות עובריות נוצרו משתי בארות של צלחת שש בארות ולמקום אותם בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.
אפשר להם להתיישב בתחתית הצינור בכוח הכבידה. ואז בזהירות שאף את התקשורת מהצינור ולחץ מחדש על הגופות העובריות בשני מיליליטר של מדיה שלב 2. מעבירים 10 עד 15 גופים עובריים ל הבאר מצופה ג'לטין המכילה 2.5 מיליליטר של מדיה שלב 2 ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
במשך שבועיים עד שלושה שבועות, לשנות את התקשורת כל שלושה עד ארבעה ימים. ציפוי של EBs הוא קריטי. פחות מ- 10 או יותר מ- 15 EBs או פיזרתם באופן לא אחיד עלולים להוביל לתשואות נמוכות של מקרופאגים.
לאחר שבועיים עד שלושה שבועות, הגופים העובריים מתחילים לשחרר תאים hematopoietic לא עקבי לתוך ההשעיה. באמצעות מסננת 40 מיקרומטר, לאסוף תאים אלה לתוך צינור 50 מיליליטר ולאחר מכן לחדש את התקשורת. צנטריפוגה ההשעיה של תאים hematopoietic ב 200 פעמים g במשך שלוש דקות.
תן מחדש את התאים ההמוטופיים במדיה בשלב 3. לאחר מכן צלחת התאים בצפיפות של 0.2 פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר. שנה את שלב שלוש המדיה כל חמישה ימים.
לאחר תשעה עד 11 ימים, המקרופאגים יהיו מובחנים לחלוטין ופונקציונליים לחלוטין. הוסיפו 8 פעמים 10 למאקרופאגים הרביעיים שמקורם ב-iPSC ל-200 מיקרוליטרים של מדיה בשלב 3 לכל באר של צלחת של 96 בארות. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון חרוזים לכל באר המכילה מקרופאגים שמקורם ב- iPSC.
השתמש במערכת דימות תוכן גבוה כדי לדמיין את הלוח. לרכוש שלושה שדות או יותר על פני כל באר כדי לקבל ייצוג טוב. מושבות iPSC, גופים עובריים, תאי השעיה hematopoietic, מקרופאגים בוגרים היו ברורים מורפולוגית.
המקרופאגים שמקורם ב-iPSC היו גדולים, היו בעלי גרעינים בודדים קטנים בצורת אליפסה והיה להם ציטופלסמה שופעת המכילה שלפוחיות רבות. פנוטיפ מקרופאג' הוערך על ידי ציטומטריית זרימה. מקרופאגים בוגרים שמקורם ב- iPSC ביטאו את סמן השושלת CD45 ואת סמן התבגרות המקרופאג ' 25F9 והם היו שליליים עבור סמן מקרופאג לא בוגר מונוציטים CD93.
מקרופאגים שמקורם ב- iPSC הביעו מספר סמני מיאלואידים של שושלת היו חיוביים עבור סמן אפנון חיסוני CD86. חלק קטן של מקרופאגים ביטא קולטני כימוקין CX3CR1, CCR2, CCR5, ו CCR8. יכולת פאגוציטית iPSC-DM הוערכה באמצעות ביו-חלקיקים ומערכת הדמיה בתכנים גבוהים.
Bioparticles היו nonfluorescent כאשר הוסיף תרבויות מקרופאג, אבל לאחר phagocytosis פלואורסצנטי ירוק בהיר ב- pH חומצי תאיים. השבר האפגוגי מייצג את שיעור המקרופאגים שהפגוציטו ביו-חלקיקים ואת המדד הפאגוגי הוא מדד מספר הביו-חלקיקים שכל מקרופאג' בלע. מקרופאגים יכולים לשנות פנוטיפ בתגובה לרמזים סביבתיים.
RT-PCR שימש לכימות ביטוי mRNA מוסדר של גנים. מקרופאגים שטופלו ב-LPS ובאינטרפרון גמא או IL4 הראו אחוז נמוך משמעותית של תאים פאגוציטים בהשוואה למאקרופאגים נאיביים. מקרופאגים שטופלו ב- IL10 הראו אחוז מוגבר של תאים פאגוציטים ומדד phagocytic מוגבר.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לספק מקור מחוץ למדף של תאים לטיפול במחלות כגון מחלת כבד כרונית שבה מקרופאגים הוכחו להיות טיפולית במודלים של בעלי חיים. ניתן להשתמש במאקרופאגים שמקורם ב- iPSC כדי לחקור מקרופאגים הקשורים למספר מצבי מחלה. לדוגמה, אנו משתמשים בתאים אלה כדי לחקור מקרופאגים הקשורים לגידולים בסרטן השד.
שינינו את הפנוטיפ של מקרופאגים שמקורם ב- iPSC על ידי תכנות גנטי באמצעות גורם שעתוק יחיד הנקרא KLF1. עם זאת, יצרנו מקרופאגים נראים כמו מקרופאגים של האי אריתרויד והם סיפקו תובנות על הייצור וההתבגרות של תאי דם אדומים.
