著者らは、この原稿の建設的なレビューのためにニロウ・サラ・アーデンと中趙を認めたいと思います。著者はまた、このプロジェクト中に不可欠なインプットのためにリンジー・ブラウンに感謝したいと思います。この作業に対する部分的な内部資金と支援は、CDERクリティカルパスプログラム(CA #1-13)とCDER製造科学イノベーションセンター・オブ・エクセレンス・プログラム(Berilla-CoE-19-49)によって提供されました。このプロジェクトは、米国エネルギー省とFDAの間の機関間協定を通じてオークリッジ科学教育研究所が運営する米国食品医薬品局バイオテクノロジー製品局のインターンシップ/研究参加プログラムによって部分的に支援されました。
この出版物は著者の見解を反映しており、FDAの見解や政策を表すものと解釈されるべきではない。

1. AWSの準備
注:このプロトコルは、1つのアクーストレティックチャンバーを使用して開発されました。しかし、ベンチスケールのAWSには、必要に応じて4つのアクロスフォレティックチャンバーを直列に動作させることができる5つの濁度プローブがあります。
<ol><li>濁度ケーブルをF、1、2、3、4(例えば、図1cの濁度プローブ1、図2aのポート1)に、チャンバーパワーBNCケーブルを1、2、3、4とラベル付けされたAWSシステムの背面に接続します(図2b)。 注:チャンバが流体で満たされている場合、ステップ2.6まで、チャンバ電源BNCケーブル(図3c)の他端を口和室の背面(図3d)に接続しないでください。チャンバーの電源がオンの場合、チャンバー内の流体がオンになっていると、チャンバー内のピエゾトランスデューサーが損傷し、機能しなくなります。</li>
	<li>濁度プローブを濁度計と温度計ハウジングに挿入し、ネジを締めます(図1cおよび図3)。</li>
	<li>フィードポンプを介してフィード濁度ポート(図4a)の入力にフィードチューブを接続します(図1b~1c)。</li>
	<li>フィード濁度ポート(図4b)の出力からyチューブを、アクロスフォレティックチャンバーの入口ポートに接続します(図4c)。</li>
	<li>ステージ1チューブを、房状室の廃口(図4d)からstage1ポンプを介して細胞回収容器に接続する(図1dは1e~1f)。</li>
	<li>房口室の透過ポート(図4e)からプローブ1濁度ポートの入力にチューブを接続する(図4f)。</li>
	<li>プローブ1濁度ポート(図4g)から収穫管を製品回収容器に接続します(図1c~1g)。</li>
</ol>2. HCCF を使用してシステムをプライムする
注:このプロトコルは、化学定義培地(6 mM L-グルタミンを用いたActiCHO P)で培養されたCHO-K1細胞を用いて開発され、IgG1モノクローナル抗体VRC0113 を製造し、他の細胞株および製品に合わせて調整する必要がある。このプロトコルで使用されるHCCFは、揺れフラスコまたはバイオリアクタープロセスからCHO-K1培養の7〜8日間の終わりに得られました。
<ol><li>AWS の背面と前面の電源スイッチをオンにして、AWS をオンにします。</li>
	<li>コンピュータの電源を入れ、関連するソフトウェアのデスク アイコンをダブルクリックします(「 資料一覧」を参照)。[読み取り値] パネルで [テストの開始] ボタンを押して、データの記録を開始します (図 5)。データの記録が開始されると、テストが停止されるまで、収集されたすべてのデータがエクスポート可能なスプレッドシートに記録されます。</li>
	<li>フィードチューブエンドを、撹拌されるHCCF容器に接続します。</li>
	<li>フィード ポンプのイメージ内の "コントロール" 画面にポンプ速度を入力し、キーボードのEnterキーを押して、フィード ポンプを起動します。「ポンプ方向矢印アイコン」(時計回りまたは反時計回り)が、送りポンプ画像の右側にある灰色のボックスで正しく選択され、HCCFが容器から房室にポンプで送り込まれるようにします。フィード ポンプ イメージの下にある灰色のボックスの横にある"三角形のアイコン" をクリックして、ポンプを開始します (図 6a)。 注:最大ポンプ速度は10 L /h(167 mL/min)ですが、このステップでは、公称流量60 mL/minを使用して、分離を開始する前にチャンバを過剰充填することなくチューブとチャンバーを素早く充填することをお勧めします。</li>
	<li>「パーセント削減パネル」(図5c)を、アフューストレティックチャンバーの充填中に観察して、飼料濁度測定を監視します。HCCFがHCCF容器に十分に混合されている場合、濁度値はチャンバのローディング中に一貫したままになります。</li>
	<li>液体がアソフォティックチャンバーの背面にあるピエゾトランスデューサーの上に入ったら、フィードポンプ画像の下の灰色のボックス内で「Off」を押してポンプを停止します。BNC電源ケーブル(図3c)をアガストレティックチャンバー(図3d)に接続します。 注:各アウストフォレティックチャンバーのホールドアップ量は約190 mLです。</li>
</ol>3. AWSの運用
<ol><li>アクトフォレティック室が充填され、BNC電源ケーブルがアクトフォティックチャンバの背面に接続されたら、フィードポンプの速度を所望の動作速度に変更します(図6a および 表1)。特定のプロセスに最適な動作パラメータを特定するために、いくつかのフィードポンプレートをテストする必要があります。</li>
	<li>電源モジュールのバーを 10 W (図 6d)にスライドし、ステージ 1 ボックスの右側にある[ON をオンにする] アイコンを押して stage1 の圧電電源をオンにします (図6c)。メーカーが提案したように、CHOセルの推奨電力設定である10 Wを使用してください。これにより、動作に対して 2 MHz の固定周波数が生成されます。数秒後、細胞はアユーストレティックチャンバーの波のノードに目に見えて集まり始めます(図7a)。</li>
	<li>細胞がアフェストレティック室の底に落ち着き始めたら(図7b)、細胞密度とフィードポンプ速度に基づいて適切な速度でstage1ポンプを開始する(図6b)。メーカーの最適化と定常動作スプレッドシートに基づいて、stage1ポンプ速度は、次の式を使用して、パックされたセル質量とフィード流量に基づいて計算することができます <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg"><ol>
<li>パックされた細胞質量を計算するには、空の15 mLチューブ(または遠心分離と互換性のある他のチューブ)でスケールを引き換えます。チューブにフィード材料を充填し、チューブの総重量をフィードで記録します。3,700 x gで 10 分間チューブを遠心分離します。上清を別の容器にデカントします。細胞ペレットでチューブの重量を測定します。充填された細胞質量の供給材料の割合=(デカンテッドチューブ重量/充填チューブ重量)x 100%。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アフュートフォレティックチャンバーからのオーバーフローが濁度プローブ1に入り込むので、ステージ1の濁度プロファイルを監視する(図8)。</li>
	<li>細胞分離が進むにつれて、細胞除去効率 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg"> が高まる。</li>
	<li>また、細胞分離が続くにつれて、フィードとステージ1の温度差が大きくなるのを監視します(図9)。高いセル密度フィードを使用すると温度が上昇する可能性がありますが、一般的にはフィードの流量を変更することで低減できます。 注:複数のアクトフォティックチャンバーを使用する場合、濁度プローブを介して以前のアクトフォティックチャンバーから現在のアクトフォレティックチャンバーの入力にチューブを順次接続できます。さらに、1つは、細胞収集容器にステージポンプを介して、アユーストフォティックチャンバーの底部からステージチューブを接続することができます。4つのアクトフォレティックチャンバーを直列に接続して、必要に応じて最適な細胞除去効率を実現します。</li>
</ol>4. AWS の終了
<ol><li>実行が終わったら、フィードポンプとstage1ポンプ画像の下のグレーボックス内でそれぞれ [Off] を押して、フィードとstage1ポンプを停止し、ポンプを停止します。</li>
	<li>ステージ 1 ボックスの右側にある [Off] を押して、チャンバーの電源を切り、BNC 電源ケーブルを外します。</li>
	<li>深度ろ過法やクロマトグラフィー法など、さらに明確化および精製手順のために収集された製品収穫材料を取ります。細胞の収穫材料を捨てます。</li>
	<li>廃棄物チューブを空の容器に入れ、口当たりの多いチャンバーの入口からチューブを切り離し、ポートに浸透させ、ポンプヘッドから廃棄物チューブを放出して、アカウストレティックチャンバー内の残りの流体を排出します。</li>
	<li>チューブを再接続し、廃チューブをポンプヘッドに戻し、フィードポンプレート60 mL/minとstage1ポンプレート60 mL/minを使用して、フィードチューブの端からDI水を流します。15~20分続けます。フローを破棄します。</li>
	<li>70%のイソプロピルアルコール(IPA)をチューブとチャンバーに送り込み、15〜20分間のフィードポンプを使用します。フローを破棄します。</li>
	<li>15~20分間のフィードポンプを使用して、DI水で洗浄手順を繰り返し、チューブとチャンバーをクリアします。フローを破棄します。</li>
	<li>濁度プローブとアガストフォレティックチャンバーからチューブを分解し、70%のIPAでエリアをきれいにします。</li>
	<li>濁度プローブを分解し、70%のIPAで濁度プローブの内部をきれいにします。すべての部品を乾燥させてから、次の使用のために再組み立てしてください。 注意:アフューストフォレティックチャンバーは、単一の使用のために製造されていますが、このプロトコルで説明されているように適切に処理および洗浄すれば再利用することができます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roush, D. J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+primary+recovery:+centrifugation+and+membrane+technology.">Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology.</a> Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).</li><li>Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+analysis+of+mammalian+cell+suspensions+for+prediction+of+industrial+centrifugation+and+its+verification.">Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).</li><li>Shukla, A. 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著者らは、この原稿に記載されている製品に金銭的な利益を持っていないし、開示する他に何もありません.

記述は、CHO細胞株のHCCFからのモデルモノクローナル抗体の一次解明におけるベンチスケールAWSの実装のためのステップバイステップのプロトコルである。代表的な結果に示すように、AWSを一次の明確化に使用すると、効果的な細胞の明確化と製品の回復が得られました。さらに、低レベルのメンテナンスと運用要件とスケールアップ機能により、一次的な明確化において、より広範なアプリケーションの可能性を実現できます。
重要なことに、代表的な結果は、フィードポンプ速度が細胞の分離にとって重要であることを示唆している。また、濁度測定で高い細胞密度を検出する際の制限により、AWS システムを使用する場合に考慮すべきもう 1 つの要因として、動作するセル密度が考慮されます。高い細胞密度供給材料を走る場合には濁度プローブが飽和してしまうため、原料の細胞密度をオフラインで測定し、細胞培養液を明確にすることで細胞分離効率を計算するのが最適な場合があります。明確化の正確なオフライン測定では、これらの問題を解決する上で考慮することができる1つのプロセス戦略は、シリーズで複数のチャンバーを使用することです。このプロトコルは主に単一のチャンバを使用することに焦点を当てていますが、このシステムは細胞の状態に最小限の影響を与え、高い製品回収をもたらす細胞の逐次的な明確化のための3つの追加のチャンバーを操作することができます。さらに、AWS の電力やセルの削除フローレートなどの他のパラメータは、特定のセルタイプや動作モードに合わせてさらに最適化できます。全体として、AWS の実装前に、これらの考慮事項を使用したオペレーションパラメータと戦略の最適化をお勧めします。
多くのアプリケーションの可能性の中で、継続的なバイオプロセシングにおけるAWSの使用は有望です。AWS は遠心分離を置き換え、フィルター表面積14を大幅に削減できるため、AWS を使用すると、連続的なバイオマニュファクチャリングと互換性のある後続のろ過およびクロマトグラフィープロセスに対して、無細胞材料の一定のフローが可能になります。この互換性と高い細胞密度(例えば、>50 x 106 細胞/mL)および培養期間の長さ(例えば、>14日)のための灌流技術の利用可能性により、AWSは一次明確化に加えて、新しい連続細胞出血戦略を開発する可能性を秘めています。
いくつかの場合において、産生されるタンパク質治療の最大30%が細胞出血物質15,16における定常操作中に除去される。さらに、除去されたモノクローナル抗体を標準の収穫材料と共にプールするためには、一定の品質属性が満たされなければならない。これらの仕様が満たされない場合、結果は製品の歩留まりに影響を与える可能性のある材料の拒否である可能性があります。このような製品損失を補うために、長期灌流プロセス17の間に、AWSを使用した細胞ブリード材料の継続的な明確化を定常状態で実装することができます。この戦略は、ブリード材料の製品損失を低減し、生産されるタンパク質の多くを利用することができます.さらに、AWS を使用した連続的な明確化後の細胞は、より高い細胞密度と生産性のために必要に応じてバイオリアクターに戻される可能性があります。したがって、AWS でセルブリード材料を連続的に明確化すると、所定のプロセスで歩留まりを増やしたり、二次フィルタの表面領域を減少させたりする機会が得られる可能性があります。
要約すると、AWS のユーティリティは、単純な一次的な明確化に限定されるものではなく、製造速度と運用の柔軟性を向上させる可能性のある連続的なバイオプロセシングのアプリケーションに対するユーティリティを備える場合があります。

分泌された治療用タンパク質を含むバイオ製造プロセスにおける重要なステップは、採取した細胞培養液(HCCF)からのバイオマスの除去です。従来、バイオメーカーは、モノクローナル抗体1の産生における主要な明確化方法として遠心分離を採用し、その後深度ろ過を採用してきた。しかし、遠心分離は細胞に高い剪断応力をもたらし、HCCFにおける細胞の破片の増加をもたらす。これはろ過中にフィルターの汚れにつながる可能性があり、その後下流クロマトグラフィー効率1、2、3を減らすことができる余分な汚染物質ポストろ過をもたらす可能性があります。さらに、特定のプロセスの遠心分離機のカスタマイズはコストがかかり、クリーンインプレースシステムと滅菌インプレースシステムへの追加接続が必要になる可能性があり、スケーラビリティの制限要因にもなります。深度フィルタの使用は、遠心分離の限界を補償し、また、シングルユース技術4を利用することができます。しかし、深度フィルタは、高い細胞培養密度5に耐えられないため、主に二次的な明確化として使用される。あるいは、接線流ろ過(TFF)細胞保持装置は、せん断応力を軽減するために採用されているが、膜分極化や収穫量不良などの課題を経験する可能性がある6。遠心分離+深度ろ過またはTFFの使用に起因する上記の問題は、HCCFの一次明確化プロセスの改善の機会を作成します。
音響分離は、高品質のタンパク質産物7,8を用いて細胞培養物から分泌されたタンパク質を収穫する技術として導入された。音響分離は、浮遊流体および保持粒子9,10と相互作用する多次元定在波の伝播および反射を通じて達成される。これらの粒子は、流体のドラッグ、重力、音響放射の 3 つの力を経験します。各力が互いに対等になると、平衡に達し、粒子が吊り下げされ、超音波定波10内に閉じ込められる。細胞培養懸濁液において、細胞は立ち波のこの圧力ノード平面内に保持され、細胞が合体するにつれてノードが成長し、最終的には重力9から細胞ノードのこれらのクラスターが落ちる。これらの沈み込み細胞は、メディアから除去され、さらに下流処理のために浄化された培地を送り出すことができます。分離方法としての超音波の利用は、脂質粒子と赤血球11の分離から哺乳動物灌流細胞培養12に至るまでの生物学的用途に翻訳し始めている。遠心、深度ろ過、またはTFFを避けることによってコスト、労力、細胞ストレスを削減する相対的な能力を持つバイオメーカーは、音響分離を使用する潜在的な用途を模索しています。
この研究は、CHO細胞培養を明確化するためのベンチトップ音響波セパレータ(AWS)を操作するための一般的なプロトコルを提供し、代表的なデータを提示し、効果的な細胞解明と製品回収を達成する方法を実証する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acoustophorectic chamber</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiCHO P</td>
			<td>GE</td>
			<td>SH31025.01</td>
			<td>powder medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AWS</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-SYS (60500101-SP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cadence Acoustic Separator Software</td>
			<td>Pall</td>
			<td>Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cells</td>
			<td>VRC</td>
			<td>VRC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Latitude 3470</td>
			<td>Windows 7, 64 bit OS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (70%)</td>
			<td>LabChem</td>
			<td>LC157605</td>
			<td>20L prepped 70% IPA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td>200 mM stock solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 14 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-14</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S 16 tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>96400-16</td>
			<td>peroxide-cured silicone tubing, 25ft</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing set</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-FP-K1 Tubing set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbidity probe</td>
			<td>Pall</td>
			<td>CAS-TS-S1 (60500106)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary clarification of cho harvested cell culture fluid using an acoustic separator

一次解明は、採取した細胞培養液内の治療製品から細胞を最初に除去するためのバイオ製造プロセスにおいて不可欠なステップである。遠心分離やろ過などの従来の方法は、細胞除去のために広く実装されていますが、これらのプロセスのための機器は、大きな足跡を持っており、操作は、汚染のリスクとフィルタの汚れを伴うことができます。さらに、従来の方法は、一次的な明確化のための連続的なバイオプロセシングスキームには理想的ではないかもしれません。このように、音響(音)波を用いた代替アプリケーションを、細胞培養液から細胞を連続的に分離することを検討した。本研究では、CHO細胞バイオリアクターの収穫からモノクローナルIgG1抗体を含む培養液を一次分離するためのベンチスケール音響波セパレータ(AWS)を用いた詳細なプロトコルです。代表的なデータは AWS から提示され、効果的な細胞の明確化と製品の回復を実現する方法を示します。最後に、継続的なバイオプロセシングにおける AWS の潜在的なアプリケーションについて説明します。全体として、この研究は、CHO細胞培養のための一次的な明確化におけるAWSの実装のための実用的かつ一般的なプロトコルを提供し、さらに連続バイオプロセシングにおけるその応用可能性について説明する。

プロトコルで説明されているように、AWS は、図1 に示すように、12.4 x 106セル/mL の密度で HCCF を明確にするために使用されました。フィードポンプは3.5mL/min(5L/日)に設定され、10~20 L培養に適した推定範囲内の細胞のブリード率を表します。HCCFがAWSチャンバーに入ると、フィード濁度プローブからの濁度測定は約1,000〜1,100 NTUと一貫しており、probe1濁度プローブからの測定値は40〜50 NTU前後にとどまりました(図8)。2つの測定を使用して、細胞の除去の効率
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg">
計算され、平均95%であった。40~50 NTUの濁度測定は最小濁度レベルであり、シリーズの追加のAWSチャンバーからのさらなる分離は実現不可能であることがわかりました。
AWSは低い流量で高効率で分離することができますが、HCCFをチャンバー内に長く保つことは温度上昇を引き起こし、より低い流量を選択する際に考慮する必要があります。 図9 は、アホストレティック室に入る前と、供給流量3.5mL/minでの音響分離後のHCCFの温度差の一例であり、音響室内で長時間の時間による温度の>6°Cの上昇を示した。
高い細胞密度収穫を実行する場合のもう一つの重要な考慮事項(すなわち、>20 x 106 細胞/mL)は、濁度プローブの飽和です。フィード濁度プローブの濁度測定は4,400 NTU(図10)を超えて飽和状態になり、細胞除去効率の計算において過小評価が生じる可能性があります。
細胞の明確化に対する異なる供給速度の効果を試験するために、細胞除去効率を異なる供給率で測定した。 図11に示すように、送出ポンプ速度が上昇するにつれて、細胞除去効率は~100%から57%に大幅に低下した。一般に、フィードポンプ速度が遅いほど、細胞の明確化が良くなります。ただし、各アプリケーションに対してフィードレートの最適化をお勧めします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg"> 図 1: AWS のセットアップソフトウェア (a) でポンプをオンにすると、HCCF はフィードポンプ (b) を介してフィード濁度プローブ (c) を介して AWS チャンバー (d) に送り込まれました。室内では、音響力が波のノードの流れから細胞を閉じ込め、束を引き起こしました。浮力の低下により細胞は重力を通して細胞が落ち込み、細胞はステージ1ポンプ(e)を介して細胞収穫ボトル(f)に細胞収穫瓶を介して口内室の廃棄物港から取り除かれ、明確化された材料は、チャンバーの透過ポート(c)から製品収穫ボトル(g)にプローブ1濁度プローブ(c)に出て行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg"> 図 2: AWS システムの背面濁度プローブとチャンバーは、濁度プローブイーサネット(a)とチャンバーパワーBNC(b)ケーブルを介して、AWSシステムの背面にあるそれぞれのポートに接続されています。また、コンピュータはPCイーサネットケーブル(c)を介して接続されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg"> 図3:濁度プローブとハウジング。各濁度プローブ(a)は、それぞれの濁度計と温度計ハウジング(b)に適切に挿入し、ネジで締める必要があります。チャンバー電源BNCケーブル(c)は、チャンバー内のピエゾトランスデューサが流体で満たされた後にのみ、アクトフォレティックチャンバー(d)の背面に接続する必要があります。プローブは、F = フィード濁度、1 = probe1濁度、および 2、3、および 4 は未使用のプローブ (または手順をシリアル化するために使用できます) として示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg"> 図4:濁りハウジングとアフューストフォレティックチャンバーとの接続。フィードチューブは、フィードポンプを介してフィード濁度ポート(a)の入力に接続されます。フィード濁度ポート(b)の出力は、yチューブを介してアクロスフォレティックチャンバ(c)の入口ポートに接続されています。stage1チューブは、房球性室の廃港(d)からstage1ポンプを介して細胞回収容器に接続される。アフューストレティック室の透過ポート(e)は、プローブ1濁度ポート(f)の入力に接続されている。収穫管は、プローブ1濁度ポート(g)から製品回収容器に接続されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg"> 図 5: 音響セパレータソフトウェアの読み取りパネルプログラムには、"読み取り" と "コントロール" の 2 つのパネルがあります。「読み取り」パネル内では、濁度(a)、温度(b)、およびパーセント低減率(c)が監視されます。データの記録を開始するには、[テストの開始] ボタン (d) をクリックする必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg"> 図 6: プログラムのコントロール パネル[コントロール] パネルでは、ポンプのオンとオフを切り替えることができ、送り込み (a) などのステージ (b) に対してポンプの速度を変更できます。また、ピエゾトランスデューサのチャンバー電源をオンまたはオフ(c)にして、スライドバー(d)で変更することができます。実験は、メーカーが推奨するCHOセルの推奨電力設定であるため、10 Wを使用しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg"> 図 7: AWS チャンバー細胞がチャンバーの中に入ると、音響力が波のノードに細胞を閉じ込め、細胞がクラスター化する(a)。これらの細胞クラスターは、浮力を失い、最終的に重力(b)によって落ち着くまでサイズが大きくなった。次に、細胞収穫ボトル(c)にstage1ポンプを介して、アユーストレティックチャンバの廃港から落ち着いた細胞を除去した。製品は透過ポート(d)を介してチャンバーを出て、HCCFは継続的に入口ポート(e)を介してチャンバーを充填した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg"> 図8:フィードポンプ速度3.5mL/minの12 x 106 細胞/mL CHO細胞培養の濁度測定。飼料濁度(青)は約1,000NTUで、ステージ1濁度計(オレンジ)を出る透過物は40~60NTUであった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg"> 図9:フィードポンプ速度3.5mL/分の12 x 106 セル/mL CHO細胞培養の温度測定。供給温度(青)は約21°Cで、ステージ1濁度計(オレンジ)を出る透過物は約27°C <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">であった。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg"> 図10:高い細胞密度サンプルの濁度測定例。細胞密度が>20 x 106 細胞/mLであった場合、供給濁度測定は4,400 NTUの最大値で飽和し、細胞除去効率の過小評価をもたらした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg"> 図11:細胞除去効率比較。供給速度が増加するにつれて、細胞分離が減少した。したがって、供給速度が増加するにつれて、細胞の明確化効率が低下した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>パラメーター</td>
			<td>仕様</td>
		</tr>
<tr>
<td>流量</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
<tr>
<td>圧力範囲</td>
			<td>0 – 2バー (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
<tr>
<td>供給液温度</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
<tr>
<td>動作温度</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:動作条件 流量、圧力範囲、供給液、および動作温度に関する AWS メーカーの推奨動作条件。

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Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

ここで提示される、音響セパレータを用いたCHO細胞培養の一次明確化のためのプロトコルである。このプロトコルは、シェイクフラスコ培養またはバイオリアクターの収穫の一次明確化に使用することができ、灌流バイオリアクター操作中の細胞ブリード材料の連続的な明確化のための潜在的な用途を有する。

音響セパレータを用いたCHO採取細胞培養液の一次解明

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

primary-clarification-cho-harvested-cell-culture-fluid-using-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.0K ビュー.  U.S. Food and Drug Administration. ここで提示される、音響セパレータを用いたCHO細胞培養の一次明確化のためのプロトコルである。このプロトコルは、シェイクフラスコ培養またはバイオリアクターの収穫の一次明確化に使用することができ、灌流バイオリアクター操作中の細胞ブリード材料の連続的な明確化のための潜在的な用途を有する。

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

アコースティック膜の微粒子技術を使用してカスタムチャイニーズハムスター卵巣-宿主細胞タンパク質のアッセイを開発する

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

生物工学

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

アコースティックMicrostreamingを使用して標準的な実験系逆転写反応でmRNAの単セルの物理量からcDNA収量を増加させる

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

腫瘍細胞の浸潤を間質液流れに及ぼす影響を測定するための三次元細胞培養モデル

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing drugs targeted at the liver, requires a platform in which cells receive proper biochemical and mechanical cues. Recent liver tissue engineering systems have employed three-dimensional (3D) scaffolds composed of synthetic or natural hydrogels, given their high water retention and their ability to provide the mechanical stimuli needed by the cells. There has been growing interest in the inverted colloidal crystal (ICC) scaffold, a recent development, which allows high spatial organization, homotypic and heterotypic cell interaction, as well as cell-extracellular matrix (ECM) interaction. Herein, we describe a protocol to fabricate the ICC scaffold using poly (ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and the particle leaching method. Briefly, a lattice is made from microsphere particles, after which a pre-polymer solution is added, properly polymerized, and the particles are then removed, or leached, using an organic solvent (e.g., tetrahydrofuran). The dissolution of the lattice results in a highly porous scaffold with controlled pore sizes and interconnectivities that allow media to reach cells more easily. This unique structure allows high surface area for the cells to adhere to as well as easy communication between pores, and the ability to coat the PEGDA ICC scaffold with proteins also shows a marked effect on cell performance. We analyze the morphology of the scaffold as well as the hepatocarcinoma cell (Huh-7.5) behavior in terms of viability and function to explore the effect of ICC structure and ECM coatings. Overall, this paper provides a detailed protocol of an emerging scaffold that has wide applications in tissue engineering, especially liver tissue engineering.

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Polyethylene glycol Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process involves seeding of epithelial cells sparsely in a 3D matrix gel on a 96-well microplate with media changes to cultivate expansion into organoids. Morphology is then assessed by whole-well capturing of z-stack images. Compression of z-stacks creates a single in-focus image from which organoids are measured to quantify a variety of outputs, including circularity, roundness, and area.DNA, RNA, and protein can be collected from organoids recovered from the matrix gel. Cell populations of interest can be assessed by organoid dissociation and flow cytometry. Formalin-fixation-paraffin-embedding (FFPE) followed by sectioning is used for the histological assessment and antibody staining. Whole-mount immunofluorescent staining preserves organoid morphology and facilitates observation of protein localization in organoids in situ. Commercial assays that are traditionally used for 2D monolayer cells can be modified for 3D organoids. Used together, the techniques in this protocol provide a robust toolbox to quantify prostate organoid growth, morphologic characteristics, and expression of differentiation markers.

Here, we present a protocol to guide human primary prostate organoid handling then suggest endpoints to assess phenotype. Seeding, culture maintenance, recovery from matrix gel, morphologic quantification, embedding and sectioning, FFPE sectioning, whole-mount staining, and application of commercial assays are described.

処理と人間プライマリ前立腺培養の評価

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

ファージ表示ペプチドライブラリーを用いて線維芽細胞増殖因子受容体2を標的とする小ペプチドのスクリーニングと同定

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632を用いた初原ヒト歯肉上皮細胞の単離と培養

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...