他の方法と比較して、このプロトコルは、新しいアンタゴニスター、アゴニスト、およびアロステリックモジュレーターを、水力希釈構造と標的タンパク質の形成を知らずに定量的かつ定性的に見つけ出す方が簡単です。このプロトコルは、高効率、取り扱いが容易、経済的、および商業的に入手可能である。この高スループットスクリーニング法をITC分析と組み合わせることで、機能的小ペプチドを定量的かつ定性的に得ることができる。
この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるイン・ジャオとチャン・ワンです。この手順を開始するには、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度でコーティングバッファーにFGFR2の溶液を調製する。35平方センチメートルの皿に溶液の1ミリリットルを追加し、表面が完全に濡れるまで繰り返し旋回します。
揺れで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、コーティング液を注ぎ、準備したブロッキング溶液を追加します。少なくとも1時間摂氏4度でインキュベートし、ブロッキング溶液を捨て、皿が乾燥しないようにしながらTBSTでプレートを6回素早く洗います。
元のファージライブラリをTBSTの1ミリリットルで再構成し、コーティングされた皿にこれを追加します。室温でプレートを静かに揺らす。その後、上清を捨て、TBSTで10回洗います。
0.2モルグリシンHCLの1ミリリットルを皿に加え、室温で10分間穏やかに揺らすことで、結合ファージをエルプします。溶出管を殺菌されたマイクロ遠心分離管に移し、pH 9.1で1モルトリスHCLの100マイクロリットルでそれを中和する。まず、準備したLBとIPTG X-Galプレートを使用前に少なくとも1時間摂氏37度で予熱します。
フィルターカートリッジとピペットチップを使用して、LBで溶出液の10倍希釈液の100マイクロリットルを調製します。調製された大腸菌培養が中ログ相に達した後、200マイクロリットルの培養液を、溶出希釈液ごとに1本の滅菌マイクロ遠心チューブに分配する。感染を開始するには、大腸菌培養物を含むチューブに各希釈液の50マイクロリットルを加える。渦を素早く、室温で5分間インキュベートします。
次に、コーティングスティックを使用して、この混合物の90マイクロリットルでLBとIPTG X-GALプレートをコーティングします。5分後、プレートを反転させ、摂氏37度で一晩インキュベートします。プラークが現れたときに数えます。
まず、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで20ミリリットルのLBで一晩培養を希釈する。増幅されていない溶出液を加え、4-1/2時間激しく揺れで摂氏37度でインキュベートします。次に、培養物を12,000倍G、摂氏4度で10分間遠心する。
上清を新鮮なチューブに移します。同じ条件を使用して再び遠心分離機を使用し、ペレットを捨てます。上清の上80%を新鮮なチューブに移し、20%ポリエチレングリコールと2.5モル塩化ナトリウムの1/6体積に加えます。
ファージを摂氏4度で一晩沈殿させます。翌日、12,000倍Gで沈殿したファージを遠心分離し、摂氏4度で15分間行う。上清と遠心分離機を同じ条件でもう一度捨てます。
ピペットを使用して残留上清を除去します。1ミリリットルのTBSでペレットを再懸濁し、上清をマイクロ遠心チューブに移します。12,000倍Gで遠心分離機、5分間摂氏4度。
上清を新鮮なマイクロ遠心分離チューブに移し、20%ポリエチレングリコールと2.5モル塩化ナトリウムの1/6体積を加えて再び沈殿します。氷の上で15〜60分間インキュベートします。次に、12,000倍Gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。
上清と遠心分離機を同じ条件でもう一度捨てます。ピペットを使用して残留上清を除去します。200マイクロリットルのTBSと遠心分離機のペレットを再懸濁して、不純物を取り除きます。
次いで上清を新鮮なマイクロ遠心チューブに移し、増幅された溶出液を得る。本研究では、FGFR2タンパク質の被覆濃度が徐々に低下する一方で、ファージ入力の数は変わらない。ファージ価の結果は、回収されたファージの数が徐々に増加し、3ラウンド後に、第1ラウンドのそれに比べて65倍の増加があることを示唆している。
次いで、FGFR2に対する小ペプチドの親和性を測定するためにITC実験を行う。結果は、SP1ペプチドがFGFR2に対して高い親和性を有することを示す。このデータは、スクリーニングプロトコルの効率を示しています。
SP1ペプチドの生物活性を調べるため、CCK-8キットを用いて線維芽細胞増殖アッセイが行われる。BALB/C3T3は、異なる濃度でSP1ペプチドと共にインキュベートされる。この結果は、SP1ペプチドが細胞の増殖を抑制することを示唆している。
野生型ファージによる汚染はここで避ける必要があります。エアロゾル耐性ピペットチップを使用してください。成長しながらファージ増幅を得る。
この手順は、炭水化物、培養細胞、および組織に結合する小さなペプチドのスクリーニングにも使用できます。これらのペプチドは、診断および標的化を介してさらに増幅することができる
