効果的な生物学的応答を確保するためには、治療薬とそのキャリアの輸送特性を特徴付けることが重要です。これらの方法は、負に荷電した組織を標的にするための最適に帯電した薬物キャリアの設計に役立ちます。これらの技術の主な利点は、組織を通じて溶質輸送を特徴付ける一連のインビトロ実験を通じて生体内治療の有効性をより良く予測する能力である。
変形性関節症などの軟骨疾患は、高密度血管軟骨マトリックスに浸透する薬物ができないことにより未治療のままであり、薬物キャリアは治療効果をプロローグする必要がある。まず、繊細な作業ワイプを使用して、直径3ミリメートル、厚さの軟骨の外植木1ミリメートルの表面から余分なPBSを静かに取り除きます。バランスを使用して、各外植の湿った重量を素早く記録し、すぐに外植物をPBS浴中に入れて脱水を防ぎます。
次に、調製したての300マイクロリットルを、96ウェルプレートの内側のウェルにウェルあたり30マイクロモル蛍光標識カチオンペプチドキャリア溶液を加え、スパチュラを使用して溶液の各ウェルに1つの外植物を加えます。300マイクロリットルのPBSで周囲の井戸をそれぞれ満たし、蓋でプレートを覆います。プレートの端を柔軟なフィルムで密封して蒸発を最小限に抑え、15ミリメートルの軌道で1分あたり50回転で24時間37°Cインキュベーターのシェーカーにプレートを置きます。
インキュベーションの終わりに、各ウェルから平衡浴を個々のポリプロピレンチューブに移し、ストック30マイクロモルカチオンペプチドキャリア溶液から連続希釈液を作り、標準曲線を生成する。次に、各溶液と標準の200マイクロリットルを黒い96ウェルプレートの個々のウェルに移し、蛍光標識の励起および発光波長に基づいて各サンプルおよび標準の蛍光測定値を得る。軟骨外植内のカチオン性ペプチドキャリア浸透の深さを決定するには、メスを使用して直径6ミリメートル、厚さ1ミリメートルの軟骨外植物を半分に切り、得られた半ディスクピースをプロテウス阻害剤補充PBSで水和します。
カスタム設計の1次元輸送室の井戸の中心にエポキシを適用し、チャンバーの上流側に面した外植の表面的な側面とウェル内の1つの半円体の外植を確保します。軟骨の拡散表面積との接触を防ぐためにウェルから余分な接着剤を除去し、外植の両側にPBSを補ったプロテアーゼ阻害剤の80マイクロリットルを追加します。出plantの片側の液体を上下にピペットし、もう一方の側に漏れをチェックします。
漏れがない場合は、上流側から添加したプロテアーゼ阻害剤を、カチオンペプチドキャリア溶液の80マイクロモル標識された80マイクロモルに置き換え、輸送室を細胞培養皿に慎重に入れます。カチオンペプチドキャリア溶液の蒸発を避けるためにPBSで皿の基部を覆います。上流と下流の部屋からの溶液間の直接接触が存在しないように注意してください。
覆われた皿をシェーカーの上に置き、室温で4〜24時間、15ミリメートルの軌道で毎分50回転の粒子堆積を制限します。インキュベーションの終わりに、チャンバーから外植を取り除き、各外植の中心から約100ミクロンの厚いスライスを切ります。ガラススライドとカバースリップの間に外植の各スライスを置き、新鮮なプロテアーゼ阻害剤を添加したPBSでスライスを水分補給します。
スライドを共焦点顕微鏡のステージに固定し、10倍の拡大でスライスの厚みを通して蛍光画像のZスタックを得ます。イメージファイルとイメージ J を開き、[イメージ] をクリックして、ドロップダウンメニューから [スタックと Z プロジェクト] を選択します。次に、スライス番号を 1 から最終スライスに入力し、[投影タイプ] で平均強度を選択して[大丈夫]をクリックします。
非平衡カチオン性ペプチドキャリア軟骨拡散率を評価するために、輸送室の各半分を組み立て、1つの大きなゴム製ガスケット、1つのポリメチルメタクリレートインサート、および1つの小さなゴムガスケットを含む。軟骨の外植の厚さを測定し、上流のチャンバーに面した表面を持つプラスチック製のインサートの井戸に外植を置き、2つの半分を挟んでアセンブリを完成させます。チレンチを使用して半分をしっかりとねじ込み、上流チャンバーに2ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤を充填し、PBSを補います。
上流の部屋からの漏出がないか下流チャンバーを点検して下流に入れられます。漏れが検出されない場合は、下流チャンバーに2ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤を添加したPBSを充填してください。上側と下流のチャンバーに単一のミニスターバーを追加し、チャンバーが整列した攪拌板の上にチャンバーを置き、分光光度計からのレーザーが下流チャンバーの中心に向かって焦点を合わせます。
分光光度計の信号受信機部分を下流チャンバの後ろに使用して、安定したリアルタイムの下流蛍光放射測定値を少なくとも5分間収集します。安定した読み取りを得た後、蛍光標識されたカチオン性ペプチドキャリアストック溶液の事前計算された体積を上流チャンバーに加えて、3マイクロモルの最終浴濃度に加え、溶質輸送が斜面の着実な増加に達することを可能にしながら下流蛍光シグナルを監視する。定常状態に達したら、上流チャンバから下流チャンバに20マイクロリットルの溶液を移してスパイク試験を行い、リアルタイムの下流蛍光測定値を収集します。
正の電荷が高すぎると、キャリアが軟骨マトリックスの負に帯電したアグリカン群に強く結合しすぎるため、表面領域への溶質の浸透が制限されます。逆に、弱い、可逆的な電荷相互作用を利用することができるキャリアは、組織の深いゾーンを貫通する。しかし、最適に荷電した薬物キャリアは、組織の深い領域に浸透するだけでなく、示すように平衡浴と組織湿潤重量の蛍光測定を使用して決定することができる高い組織内取り込みを実証するであろう。
非平衡拡散輸送実験は、徐々に上昇する傾きを持つデータ生成された曲線をもたらす。曲線の最初の部分は、溶質マトリックス結合相互作用が発生する場合に軟骨を通る溶質拡散を表します。溶体が下流チャンバーに到達すると、蛍光測定値が時間の経過とともに増加するにつれて曲線の傾きが増加します。
カーブのこの 2 番目の部分は、定常状態拡散を表す安定した傾斜に達します。曲線の定常状態部分で描かれた接線の X-切片は、定常状態拡散またはタウラグに到達するまでにかかる時間を示します。上流から下流チャンバへの溶液移動後、蛍光のスパイクが観察され、その時点で安定化蛍光強度を使用して、蛍光を濃度に相関させることができる。
代表の有効拡散率と定常拡散値を示されるように計算することができます。定常拡散率は、すべての電荷ベースの結合部位が占有された結果として、有効な拡散率より2桁高くなることに注意してください。したがって、この時点で、拡散は、サイズに基づくものであり、かつ、充電されず、同じサイズのCPC間で同様の定常拡散値をもたらす。
軟骨の形態と溶液濃度の変化を防止し、正確で再現可能なデータ取得を確実にするために、実験全体を通じて外植水和を維持し、溶液の蒸発を最小限に抑えます。最適に荷電した薬物キャリアの設計に続いて、様々な結合技術を利用して、組織標的化を強化するための薬物を修飾し、それらの生物学的有効性の評価を容易にすることができる。
