DetectSynは、近接ライゲーションアッセイ技術を利用して、シナプスの変化を迅速に特定します。また、結果を分析するためのプロトコルも提供しています。DetectSynの主な利点は、分析可能な組織の広い領域で結果が得られる速さです。
まず、細胞を乱すことなく、プラスチック製のパスツールピペットでブロッキング溶液を慎重に取り除きます。それからパラフィルムで大きなプラスチック製のペトリ皿を並べる。そして鉗子を使って、カバースリップをパラフィルムに慎重に移します。
60マイクロリットルの一次抗体溶液をカバースリップの上部に加え、抗体溶液がカバースリップの側面にこぼれないようにします。湿度を確保し、インキュベーション中にサンプルが乾燥するのを防ぐために、超純水を小さなペトリ皿に加え、カバースリップの周りに皿を慎重に置きます。次いで、より大きなシャーレを覆い、培養細胞を室温で1時間インキュベートする。
一次抗体とのインキュベーション後、鉗子を使用してカバースリップからペーパータオルに一次抗体溶液を慎重にタップオフし、カバースリップを500マイクロリットルのPBSで満たされた元の24ウェルプレートに移します。次いで、サンプルをPBSで3回、それぞれ10分間、オービタルシェーカー上で穏やかな攪拌で洗浄する。最後の洗浄後、カバースリップを大きなペトリ皿に戻し、カバースリップの上部に40マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。
ペトリ皿を覆い、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートする。ライゲーションの場合、リガーゼをコールドブロック上に保持しながら、ライゲーションストックを使用してリガーゼ1〜40を希釈し、直ちに40マイクロリットルのリガーゼミックスをカバースリップに加える。ペトリ皿を覆い、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートする。
増幅のために、増幅ストックを使用してコールドブロック上でポリメラーゼ1280を希釈する。次いで、40マイクロリットルの増幅ミックスをカバースリップに加え、サンプルを摂氏37度で100分間インキュベートする。次に、マウントのために、3マイクロリットルのマウントメディアをスライド上に落とします。
カバースリップから余分な洗浄バッファーをタップオフし、細胞が取り付け媒体に下を向いた状態でカバースリップを置きます。カバースリップを所定の位置に保持するために、少量の透明なマニキュアで側面をシールします。スライスした組織を取り付けるには、組織スライスを用意したスライドに慎重に移し、平らに置きます。
次いで、5〜10マイクロリットルのマウント培地を組織スライス上に滴下する。前述のように、ガラスカバースリップをティッシュスライスの上に置き、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。共焦点顕微鏡によるデジタルイメージングでは、各蛍光チャンネルのゲイン、オフセット、レーザーパワーを調整して、バックグラウンドノイズを低減し、蛍光シグナルを強化します。
蛍光シグナルが過飽和になっていないことを確認します。培養ニューロンについては、[ND取得]タブで、[ファイルに保存]をクリックします。次に、[参照] で、画像を保存するファイルを選択し、ファイル名を入力します。
次に、[Z] タブで、[範囲で定義される対称モード] オプションを選択します。フォーカスを最適なマップ 2 平面に設定し、[相対] ボタンをクリックして、このフォーカル プレーンを Z スタックの中央として設定します。次に、範囲を1マイクロメートルステップで5マイクロメートルに設定し、Z移動中にアクティブなシャッターを閉じるをチェックします。
「波長」タブで、「オプティカル構成」で以前に構成した集録設定でオプティカルボタンの名前を選択し、「今すぐ実行」をクリックします。スライスされた組織の場合、取得メニューから「大きな画像をスキャン」を選択し、キャプチャパネルの下で、以前に構成した集録設定の光学ボタンを選択します。また、このパネルで正しい目的を選択します。
次に、エリアパネルとアイピースの下で、矢印キーを使用して、関心領域またはROIの境界を設定します。次に、[大きな画像をファイルに保存]をクリックし、画像の保存パスファイル名を作成します。最後に、セットアップパネルで、マルチチャンネルキャプチャがチェックされていることを確認します。
次に、オプティカルコンフィギュレーションで以前に設定した集録設定でオプティカルボタンの名前を選択します。ImageJ で、画像メニューに移動し、[調整]、[しきい値] の順にクリックして、しきい値オプションを開きます。画像の背景が暗い場合は、[暗い背景]オプションを選択します。
次に、以前に決定した最適化されたしきい値設定ごとにしきい値の上限と下限を調整し、[適用]をクリックします。培養細胞の場合、MAP2チャネルとフリーハンドROIツールを使用して、樹状突起およびソーマを含む各ニューロンのROIを描画します。スライスされた組織の場合、関心領域をカプセル化するスライス画像内にフリーハンドROIを描画する。
次に、[分析]メニューを開き、[測定]をクリックしてROIの領域を取得します。各ROI内のプンタの数を検出するには、粒子分析などの自動検出ツールを使用します。[解析]メニューから[解析されたパーティクル]を選択し、穿刺サイズの直径を定義します。
次に、[表示]ドロップダウンメニューから[オーバーレイマスク]オプションを選択し、[結果の表示]オプションをオンにして[OK]をクリックします。プンタの数を個々のROIの面積で割るには、結果ポップアップから各画像の結果をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。取得したファイルを特定し、データを取得してサンプリングし、ROI の領域をプンタの数で割ります。
最後に、結果を対照サンプルに正規化するために、対照試料の結果を平均化し、得られたすべての試料の結果を対照の平均で除算する。GABABアゴニストであるバクロフェンは、迅速な抗うつ薬Ro-256981のインビトロ有効性に必要である。シナプス形成の増加は、白色プンタの増加によって実証される。
バクロフェンがなければ、シナプス形成の増加は見られない。インビボでは、迅速な抗うつ薬の腹腔内注射は、生理食塩水対照と比較してシナプス形成の増加をもたらす。テクニカルコントロール画像にはいくつかのプンタが表示されますが、他のパネルの大きなプンタと比較して、白い仕様で示されているサイズとは通常同じではありません。
さらに、これらのプンタは、ソーマ内に現れるいくつかのプンタによって実証されたのと同じ場所にはない。DetectSynは、疾患状態または薬物治療によるシナプスの変化を同定することができる。この方法は、シナプスの発達または分解に影響を与える障害を研究する研究のあらゆる分野に洞察を提供するのに役立ちます。
