このビデオプロトコルの目的は、胚マウス神経幹細胞の分離と培養のためのソースと効率的なプロトコルを確立することです。こんにちは、私はマリアム・サデギ=ザデです。私は、ロワイヤン研究所の細胞分子生物学の修士課程です。
今日、私と私の同僚は、13胚マウス神経節性エミネンスから神経幹細胞を収穫する方法を紹介したいと思っています。こんにちは、私はバハレ・アリザデ=ショオルェスタンです。私はロワイヤンバイオテクノロジー研究所の幹細胞学科で細胞分子生物学の修士課程を修了しました。
こんにちは、私はレザ・デハニ・ヴァルナムハスティです。また、私は、ロワイヤン研究所で細胞分子生物学を勉強しています。外科的処置には、子宮から各13個のマウス胚を収穫することがある。
頭蓋骨から脳を抽出する曲がった針の先端で胚のフォンタネルの前部を切断する。神経節性のエミネンスを収穫するために孤立した脳の微小解剖。単一細胞懸濁液を得るために神経幹細胞培地中で収穫された組織の解離。
そして最後に、懸濁液培養中の細胞をめっきし、神経細胞を生成する。70%エタノールを噴霧することにより、腹部領域の皮膚を清潔に消毒する。皮膚の上腹部をコントロールし、腹腔と子宮の角を明らかにするためにはさみで皮膚と下線付きの顔を切ります。
胚を含む子宮角をはさみで取り除き、25ml冷たいHEPES MEMバッファーを含む50mlの円錐状のチューブに移します。円錐管をラミナルフローフードの下に置きます。フードの下のキャップを開きます。
チューブから子宮ホーンを取り出し、残骸や血液を除去するために新鮮な冷たいHEPES MEMバッファーの十分な量で3回すすいでください。子宮組織を7〜10mlの冷たいHEPES MEMバッファーを含む10cmシャーレに移します。細かいはさみを使用して子宮の角を開き、7〜10mlの冷たいHEPES MEMバッファーを含む新しい皿に胚を移します。
今、マイクロ解剖操作のための解剖顕微鏡の下に胚と10cm皿を置きます。スチール製のメスの刃のハンドルに先端を押して、注射針の先端を曲げます。針の先端を、70~90度の角度で曲げるまで曲げます。
解剖顕微鏡の下の針の先端をチェックして、針の先端の曲がっているのを見てください。当然のことながら、胚はこれに横位置を有する。位置を変えることなく、細かい鉗子で胚の首と体を保持し、針の曲がった部分を胚頭部のフォンタナネルの前部に深く挿入する。
そこには小さな出血や血栓があるでしょう。曲がった部分が額に向かって膨らみの内側にある間、針の先端を表面的に動かし、次に頭の後ろに向かって動かします。皮膚と頭蓋骨を切断し、基礎となる脳に損傷を与えないようにしてください。
針の先端で皮膚を横に押して脳を明らかにする。皮膚の側面から、皮膚の側面から脳の下の領域までのフレームの下に針を挿入します。そして、解剖された頭蓋骨から出てくるそれを押すことによって、この頭皮から脳を取り除く。
神経節のエミネンスは、その内側と横の部分でビデオで明確に示されています。ケア鉗子を使用して脳を安定に保持し、マイクロシザーを使用して各半球の皮質を切断して神経節系のエミネンスを露出させた。脳を保持し、神経幹細胞培地を含む15ml遠心分離管に解剖された神経節のエミネンスを置く。
すべての脳がマイクロ解剖されるまで、この手順を繰り返します。チューブの底部にピペットチップを置き、2回の間、重合液を上下に置いて解剖された神経節性のエミネンスをカットし、組織を分解して単一の細胞懸濁液を得る。懸濁液を110gで5分間遠心分離する。
上清を取り除き、EDTAの1mlの0.05%チューブで細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を摂氏37度で10分間インキュベートする。そして、トリプシン活性を停止するために大豆トリプシン阻害剤の同等の量を追加します。
トリプシンが完全に不活性化されていることを確認するために、細胞懸濁液を上下にピペット。細胞懸濁液を110gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、完全な神経幹細胞培地の1mlで細胞を再懸濁し、細胞の数を数えます。
神経幹細胞培地の細胞を適当なサイズの組織培養フラスコにプレートします。2T25の5ml、T75に20ml、T175フラスコに40mlを移す。神経球は5%CO2の加湿インキュベーターで摂氏37度で3日間培養した後に現れる。
神経球を培養するには、懸濁した神経球を含む培地を遠心分離機に5分間110gで遠心分離機に移し、上清を捨てる。0.05%トリプシンEDTAの1 mlで、摂氏37度で10分間インキュベートする。次に、大豆タイプシン阻害剤を使用してトリプシンを不活性化し、神経球を穏やかに上下にピペットして単一の細胞にします。
細胞懸濁液を110gで5分間遠心分離する。上清を捨て、1mlの神経幹細胞培地で細胞を再懸濁する。これらの細胞は、高度な実験のためにラミネートおよび完全にコーティングされた表面上の次のステップ培養または培養の準備ができています。
7日後に100万個の一次神経幹細胞を培養することで、細胞数は300万~400万個に増加する。6〜7日後、球体は直径150〜200マイクロメートルの間で測定する必要があり、ニューロン分化のためのbFGFおよびEGFがない場合にラミネートポリオルニチンコーティングされた皿のサブ培養の準備ができています。フローサイトメトリーアッセイの結果は、神経球を構成する細胞のほぼ95%が神経幹細胞の既知のマーカーであるNestin陽性であることを示している。
βチューブリンIIIおよび神経節線維性タンパク質抗体を用いたアッセイは、94%の周りに塗られた表面に神経幹細胞を培養することによって、神経表現型を示し、約5%がグリア表現型を示していることを明らかにした。この短いビデオでは、13個のマウス胚神経節性エミネンスから神経幹細胞を迅速に単離するためのラボ技術。神経幹細胞の培養で成功を収めればと思います。
