上海第9人民病院頭蓋顔面異常研究センターのデジタル化された病頭学研究センターの支援に感謝します。本稿の研究は中国国立自然科学財団(NSFC)からの助成金によって支えられている[81570950、81870740、81800949]、 上海サミット&高原分野、上海精密医学研究所、上海九人民病院、上海交通大学医学部[JC201809]、上海交通大学医学部の高レベルイノベーションチームインセンティブプロジェクト。L.J.は、優れた青少年医療人材、上海「医療人材の新星」青少年育成プログラム、上海交通大学の「陳興」プロジェクトの学者です。

本論文の動物実験手順はすべて、上海交通医科大学上海交通医院動物ケア委員会によって承認された。
1. 準備
<ol><li>実験には5週齢のオスのスプレイグ・ドーリーラットを2匹使用してください。</li>
	<li>針ホルダー、ピンセット、ハサミを含むすべての器具を高温で殺菌するか、75%エタノールに10分間浸漬します。 注:エタノール浸漬は、細胞の損傷を避けるために長すぎないようにしてください。</li>
	<li>培養培地を事前に準備し、その構成を 表1に示す。以下に説明する各培地を補足する。<ol>
<li>α-MEM培地の調製(10%FBS):10%の胎児ウシ血清および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを用いた最小必須培地アルファ(α-MEM)を補う。</li>
		<li>骨形成分化培地の調製:骨形成分化基底培地を10%胎児ウシ血清、1%グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.20%アスコルビン酸、1%βグリセロリン酸および0.01%デキサメタゾンを添加する。</li>
		<li>骨形成誘導培地の調製:70%α-MEM培地(10%FBS)と30%の骨形成分化培地を混合する。</li>
		<li>アディポ原性分化培地Aの調製:10%の胎児ウシ血清、1%グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.20%インスリン、0.10%IBMX、0.10%ロシグリタゾンおよび0.01%デタゾンを有する付加的な分化基底液培地。</li>
		<li>アディポ原性分化培地Bの調製:10%の牛血清、1%のウシ胎児血清、1%のペニシリン連鎖球菌および0.20%インスリンを有する付加的分化基底培地を補足する。</li>
		<li>軟骨発生分化培地の調製:0.01%デキサメタゾン、0.30%アスコルビン酸、1%ITS、0.10%ピルビン酸ナトリウム、0.10%プロリンおよび1%TGF-β3を有するコンドロゲン分化基底培地を補足する。 注: 骨形成分化培地は、構成後1ヶ月以内に使い切る必要があります。構成された軟骨発生分化培地の有効期間は12時間である。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ラットmMCの分離と栽培
注: 細胞の生存率を維持するために、すべての実験操作を氷上で可能な限り実行する必要があります。
<ol><li>ラット下顎の収穫<ol>
<li>CO2 窒息によって2匹の5週齢の雄のスプレイグ・ドーリーラットを安楽死させる。実験を進める前に、動物の呼吸が止まっていることを確認してください。</li>
		<li>これらのラットを3分間75%エタノールを含むビーカーでリンスする。</li>
		<li>ネズミを清潔な煙のフードの中に入れて下顎を収穫します。 注:使用前に30分間紫外線照射でヒュームフードを殺菌してください。</li>
		<li>ラットをサピーヌの位置に置きます。両側性アングルスオリスから下切歯を有する唯一の可動骨である下顎骨の後部領域に皮膚およびブハネーター筋肉を切開する。 注:明確な操作フィールドを得るためにアングルスの両側に2cmの切開を行うことをお勧めします。</li>
		<li>両親指で上顎および下顎切歯を反対方向に押し出してラットの口を開き、下顎に付着した下顎歯を露出させる。</li>
		<li>頬筋と角筋と下顎下の下の境界に取り付けられた腱を完全に切断します。 注:筋肉の緊張の欠如のために、このステップ中に下顎の移動性の増加が観察されます。</li>
		<li>下顎後歯を押し、両側の顆がはっきりと露出するまで前後に回転します。 注:このステップは、人工的にラットの口を開いて、コンディレを外す可能性のある最大限の範囲で行います。下顎骨は両側の顆を通して頭蓋骨に接続されているので、顆の暴露は頭蓋骨と下顎骨の間の切断につながる。</li>
		<li>下顎骨の体を頭蓋骨から分離します。</li>
		<li>濡れたガーゼを使用して、骨表面の付着性の軟組織を洗浄します。</li>
		<li>生存率を維持するために、氷の上に予冷された最低必須培地α(α-MEM)またはリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で満たされた10cmの無菌ガラス皿に骨を入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSCsの分離と栽培<ol>
<li>下顎体から最初の臼歯の間縁に沿って前骨を切り落とす。骨髄腔を露出させるために、3番目の大臼歯の遠位縁に沿って、コラコイドと顆を含む下顎のラムスを取り除きます。</li>
		<li>10 cmの無菌ガラス皿に10 mLのα-MEM(10%FBS)を充填します。</li>
		<li>1 mL シリンジを使用して、α-MEM培地を吸引します。注射針を骨髄腔に挿入すると、骨髄を皿に繰り返し洗い流す。骨が白くなるまで、骨の前後側から骨腔を少なくとも3回洗い流す。 注:これは、ラット下顎骨の骨髄腔が長い骨ほど明白ではなく、針を挿入するための適切な点を経験的に決定する必要があるため、最も重要なステップです。上記の実験サンプルはすべて、細胞の生存率を維持するために氷の上に保存する必要がありますので、操作時間は2時間以下でなければなりません。</li>
		<li>洗い流された細胞を含む培地を15mL遠心管に移し、4°Cで 800xg の遠心分離機を5分間移動させます。上清を捨てます。</li>
		<li>セルを3 mLのα-MEMで再中断します(FBSが10%)。新しい10cm培養皿に細胞をプレートし、5%CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします。</li>
		<li>培養3日目にこれらの細胞の形態変化と成長を確認してください。非接着性細胞および組織断片を含む培地を除去する。10 mLの新鮮なα-MEM(FBS 10%)をそっと加えます。</li>
		<li>培養7日後、P0 mBMSCは70~80%の合流に達した。</li>
	</ol></li>
	<li>フローセルの並べ替え 注: P0 mBMSC は、フローセルのソートによって、典型的に同定され、主に精製されました。<ol>
<li>吸引し、培養液を捨て、その後PBSで皿を洗います。PBS を破棄します。</li>
		<li>0.25%のトリプシンを1 mL加え、0.02%EDTAを皿に入れます。37°Cで5分間細胞を消化し、2mLのα-MEM(10%FBS)を加えて反応を止めます。</li>
		<li>細胞懸濁液を15mL遠心チューブに移し、800 x g で遠心分離機を5分間移動します。</li>
		<li>遠心分離後、PBSの120 μL(10%FBS)で細胞を再懸濁します。</li>
		<li>これらの細胞懸濁液を、CD16/CD32に対して1μLの抗体を4°Cで15分間ブロックします。</li>
		<li>細胞懸濁液100μLを新しいマイクロ遠心分離管に移し、CD45に対するフィコエリスリン(PE)共役抗体で細胞を染色し、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)-CD90およびAllophycocyanin(APC)抗体に対して13°Cで13°13°の間にCD29抗体を結合させた抗体この実験で使用した抗体の濃度を表2に示す。他の20μLの細胞懸濁液を無染色陰性対照として使用してください。</li>
		<li>その後、チューブを800 x g で5分間遠心し、懸濁液を捨て、細胞をPBSの0.5 mL(10%FBS)で再懸濁します。</li>
		<li>分析前に10分間0.01mg/mL DAPIの10 μLを加えます。</li>
		<li>遠心分離管に配置された40nmフィルターを使用して細胞をフィルター処理します。</li>
		<li>蛍光活性化細胞ソーター上の細胞を分析する。パネルを次のように設定します。まず、DAPI-細胞、次にCD29+CD90+CD45-を標的mBMSCsとして選択した細胞にゲートして、細胞総数から死んだ細胞を除去する。</li>
		<li>ソートされたCD29+CD90+CD45-細胞を3mLのα-MEM(10%FBS)をあらかじめ用意した15 mL遠心管に集める。</li>
		<li>チューブを800 x g で5分間遠心します。収集バッファーを取り外し、1 mL の新鮮な α-MEM (10% FBS) を追加してセルを再中断します。その後、6 cmの文化皿に入れてお皿に入れます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. コロニー形成能力
注: このステップは mBMSCs の区分能力をチェックするために実行されました。15
<ol><li>この実験では、2番目のパッセージmBMSCs(P2)を選択します。細胞合流が80%から90%に達したら、細胞を6ウェルプレートの連続勾配で再播種して、そのクローン増殖能力を評価する。 注:1ウェルあたり1 x 102 から1 x 103 細胞の勾配を設定することをお勧めしますが、人間または動物起源の異なる細胞株の最終的な希釈は経験的に決定されました。</li>
	<li>α-MEM(10%FBS)の細胞を、かなりの数のコロニー形成ユニットが光顕微鏡下で見られるまで約2週間培養した。3日ごとに培地をリフレッシュしてください。</li>
	<li>培地を吸引して廃棄し、一度に5分間PBSでウェルを2回洗浄する。次に、各ウェルに4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、少なくとも10分間固定します。</li>
	<li>パラホルムアルデヒドを取り出し、PBSでウェルを2回リンスします。</li>
	<li>結晶紫色染色液で細胞を染色し、37°Cで約10分間インキュベートします。 注:染色時間は、所望のシェードが達成されるまで適切に調整されました。</li>
	<li>染色液を取り出し、蒸留水でサンプルを洗浄して反応を止めます。</li>
	<li>実体顕微鏡下での画像と、少なくとも50個の細胞から成る散乱細胞コロニーを数える。</li>
</ol>4. mMC の多系統分化
注: P2 mBMSCs は、特に説明がない限り、その後の実験に使用されました。
<ol><li>mBMSCsの骨形成誘導<ol>
<li>上記の手順で mBMSCs をダイジェストにします。1 2 mL α-MEM(10%FBS)を補った12ウェルプレートの2.5x 10 5 /cm2 の密度で細胞をシードします。</li>
		<li>細胞合流が60〜70%に達すると、培地を30%骨形成誘導培地に変更する。α-MEM(10%FBS)を陰性対照として細胞を培養し、2日ごとに培地を変化させる。 注:骨形成中に多数のカルシウム結節が出現した後、骨芽細胞が浮遊するのを防ぐために、2日ごとに中量媒体交換に媒体交換パターンを変更することをお勧めします。</li>
		<li>7日間培養した後、アルカリホスファターゼ染色16,17によるこれらの細胞の石灰化を評価する。</li>
		<li>培養培地を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。1ウェルあたり1 mLのPBSを3分間2回使用して細胞をリンスします。</li>
		<li>次にアルカリホスファターゼ染色液で細胞を染色し、37°Cで10〜30分間インキュベートします。 注:インキュベーションは、必要な色を得るために室温で一晩行うことができます。</li>
		<li>反応を止めるために蒸留水で井戸を洗います。軽顕微鏡で写真を撮る。赤色素色素顆粒はアルカリホスファターゼ(ALP)活性を表す。</li>
		<li>残りの細胞をさらに7日間培養した後、アリザリン赤染色を行い、細胞のミネラル化能力を評価する。</li>
		<li>10分間16、18の細胞固定後に0.5%アリザリン赤染色液で細胞を染色する。3~5分後に蒸留水で発泡反応を止めます。 注:反応時間は、開発した色に応じて延長することができます。</li>
		<li>最後に、培養プレートを光学顕微鏡の下に置き、骨形成染色の効果を観察します。赤い結節は、これらの細胞のカルシウム沈着を示す。</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSCsのアディポジェニック誘導<ol>
<li>P2 mBMSCsを上記の12ウェルプレートにシードします。</li>
		<li>ウェルが90%コンフルエントになった後、a.α-MEM培地で培養した細胞(10%FBS)を負の対照として使用して、細胞を培養する。</li>
		<li>2日間の誘導の後、培地Aをウェルから吸引し、各ウェルに1mLのアディポジェニック分化培地Bを加える。</li>
		<li>1日後、培地Bを取り除き、ミディアムAを井戸に戻してサイクルを再開します。培地AとBを用いて細胞を交互に培養する。</li>
		<li>分化培地AとBを3サイクルに交互に適用し、油赤O染色16、18によってこれらの細胞の脂質生成を検出する。 注:丸い、大きな脂質の液滴の多くは、さらに2〜3日間分化培地Bでこれらの細胞を培養することによって観察することができます。</li>
		<li>培地を取り出し、4%パラホルムアルデヒドで細胞を10分間固定します。PBSで細胞を洗い流します。</li>
		<li>油の赤色O染色液で細胞を染色し、37°Cで約3分間インキュベートする。</li>
		<li>染色液を取り除き、蒸留水で井戸を洗います。</li>
		<li>軽顕微鏡での脂質生成を観察します。</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSCsの軟骨形成誘導<ol>
<li>P2 mBMSCsを15 mL遠心分離管に5 x 105/cm 2の密度で入れました。</li>
		<li>チューブを300 x g で5分間遠心します。上清を捨てます。</li>
		<li>0.5 mLの軟骨発生分化培地で細胞を再懸濁する。5分間 300xg で細胞を遠心分離する。</li>
		<li>遠心管のキャップを緩め、37°Cで5%CO2インキュベーターでインキュベートします。2日ごとに培地を更新します。 注:細胞は24時間後にペレットを開始します。遠心分離管を48時間動かさないのが推奨されます。培地を変える時は細胞ペレットを吸引しないように注意してください。</li>
		<li>21日間の誘導後、4%パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを固定し、続いて脱水、パラフィン埋め込み、切除を行います。</li>
		<li>脱パラフィンと水和後、アルシアブルー溶液中のスライドを少なくとも18、19、20、21分間染色し、蒸留水で洗浄して反応を停止します。写真を光顕微鏡で撮影します。</li>
		<li>コラーゲンII型の免疫蛍光染色については、以下の手順を行う。<ol>
<li>脱パラフィンと水和のステップの後、37 °Cで15分間5μg/mLプロテイナーゼKでスライドをインキュベートします。</li>
			<li>37°Cで1時間ブロッキングバッファーにスライドをインキュベートします。</li>
			<li>200μLのブロッキングバッファーに1μLのコラーゲンII抗体をスライドに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
			<li>翌日、PBSでスライドを2回洗浄し、37°Cで2次抗体を1時間インキュベートします。</li>
			<li>スライスを40,6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)で10分間インキュベートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>蛍光顕微鏡下で各スライドの写真を撮ります。</li>
	</ol></li>
</ol>5. リアルタイム PCR
<ol><li>市販の試薬に基づいてグアニジウムイソチオシアネートを使用してmBMSCから総RNAを抽出する。</li>
	<li>市販のキットを使用して、RNAを相補的なDNAに逆転写します。逆転写の反応条件は、5分間65°C、15分間37°C、15sで85°Cである。</li>
	<li>表3に記載されているプライマーを用いて骨形成および脂質生成特異的遺伝子を検出するためにリアルタイムPCRを行 う。 PCR増幅手順は、5sの場合は5分間95°C、40サイクルの場合は30sの場合は60°Cの95°Cである。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+education+for+medical+students+at+Tongji+University:+Primary+cell+culture+and+directional+differentiation+of+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).</li><li>Chu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Update+on+the+Progress+of+Isolation,+Culture,+Storage,+and+Clinical+Application+of+Human+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem/Stromal+Cells.">An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).</li><li>Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+mesenchymal+stem+cell+therapy+for+ovariectomized+osteoporotic+rats:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li><li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+mesenchymal+stem+cells+of+different+origin.">Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).</li><li>Lloyd, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+differences+between+porcine+mandibular+and+limb+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+use+of+adipose+tissue-derived+and+bone+marrow-derived+stem+cells+for+rapid+bone+regeneration.">Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).</li><li>Stefanik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparate+osteogenic+response+of+mandible+and+iliac+crest+bone+marrow+stromal+cells+to+pamidronate.">Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate.</a> Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).</li><li>Aghaloo, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+potential+of+mandibular+vs.+long-bone+marrow+stromal+cells.">Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells.</a> Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).</li><li>Kaigler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+craniofacial+bone+regeneration:+a+randomized,+controlled+feasibility+trial.">Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial.</a> Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).</li><li>Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+osteogenic+differentiation+potential+of+rat+mandibular+and+femoral+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.</a> Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).</li><li>Matsubara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+bone+marrow+as+a+cell+source+for+regenerative+medicine:+differences+between+alveolar+and+iliac+bone+marrow+stromal+cells.">Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).</li><li>Chan, C. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Human+Skeletal+Stem+Cell.">Identification of the Human Skeletal Stem Cell.</a> Cell. 175 (1), 43-56 (2018).</li><li>Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+stem+cells:+nature,+biology,+and+potential+applications.">Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications.</a> Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icariin+prevents+oestrogen+deficiency-induced+alveolar+bone+loss+through+promoting+osteogenesis+via+STAT3.">Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3.</a> Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).</li><li>Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+response+of+mesenchymal+stem+cells+to+continuous+mechanical+strain+is+dependent+on+ERK1/2-Runx2+signaling.">Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling.</a> Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone.">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).</li><li>Lach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+under+Controllable+Serum-Free+Conditions.">Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).</li><li>Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+the+WNT-Signaling+Modulators+BIO+and+PKF118-310+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).</li><li>Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Chondrogenic+Differentiation+Potential+of+Equine+Synovial+Membrane-Derived+and+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).</li><li>Li, X., Zhang, Y., Qi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+isolation+methods+and+culture+conditions+for+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).</li><li>Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+(bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells)+for+bone+tissue+engineering:+basic+science+to+clinical+translation.">Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal(mesenchymal)+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture.">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).</li></ol>

すべての著者は、彼らが利益相反を持っていないと述べています。

このプロトコルは、骨髄付着と蛍光細胞選別を組み合わせることによって、ラット下顎骨からBMCを分離する方法を説明する。この方法は、フローセルソーティングによってmBMSCを予備的に精製することができますが、細胞の均質性に対してより高い要件がある場合は、より正確な精製方法が必要になる可能性があります。
現在、mBMSCsの単離に使用される4つの主要な技術?...

骨髄間葉系幹細胞(BMC)は、強い増殖能力および多系統分化電位1、2、3、4を示す骨髄由来の非造血幹細胞である。確かに、BMCは発見されて以来、骨組織工学と再生の理想的な候補と考えられてきました。何年もの間、腸骨の紋章や脛骨や大腿骨などの長い骨は、頭蓋顔面再生のためのBMSCの最も一般的な供給源であった。しかし、下顎骨BMC(mBMSC)などの顔面BMSCsは、異なる胚起源および発達パターンなどの長い骨BMSCとのいくつかの違いを示す。下顎骨は神経摘出胚層の神経堤細胞から生じ、内在性骨軟化を受け、軸および付加的骨格は中胚体からであり、内因性骨化を受ける。さらに、臨床観察および実験動物研究は、一貫して、オロフェイシャルと腸骨紋BMC5、6、7、8の間に機能的な違いがあることを示している。報告によると、下顎骨、上顎骨、歯槽骨などの頭蓋顔面骨に由来するBmSCは、軸骨および付属骨からのものよりも優れた増殖、寿命、および分化能力を示した。mBMSCは、したがって、ケルビズム、顎腫瘍、顎骨の骨粗鬆症、および歯周組織欠損10、11、12などの頭蓋顔面疾患の将来の治療用途に好まれるリソースであると考えられる。前臨床実験における治療の可能性を理解するためには、インビトロでmBMSCを迅速に単離・培養する方法を確立することが不可欠である。
本研究では、骨髄全体の付着とフローサイトメトリー選別により精製mBMSCsを得ることを目的とした。ラット下顎骨の解剖学的形態は、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)および組織学的切片を通して明確に観察され、下顎骨の骨膜骨が切歯髄腔と歯槽骨の間であることを示した。骨蓋骨から骨髄を洗い流して下顎骨細胞を得たが、この方法で培養した細胞は純粋なmBMSCではなく、骨、脂肪および内皮細胞13、14の細胞のような不確実なポテンシーおよび多様な系統を有する複数のタイプの細胞から成る可能性が高い。細胞浄化の次のステップは特に重要であった。フローサイトメトリーは、細胞表面タンパク質の組み合わせを認識して細胞をフィルターし、間葉系幹細胞の濃縮に広く採用されています。細胞の均質性はフローサイトメトリーの主な利点であるが、プロセスは細胞の生存率を決定せず、細胞収量が制限される可能性がある。本研究では、骨髄全体の付着から得られたP0 mBMSCをフローサイトメトリーで選別し、高純度で増殖能力の高いmBMSCsを得た。
本研究では、骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせて、ラット下顎骨BMSCの分離、培養、分化のための再現性と信頼性の高いプロトコルを紹介する。関連分野の研究者が利用できる、信頼できる便利な方法です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acutenaculum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipogenic differentiation medium</td>
			<td>Cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-Minimum essential medium</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30265.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -CollagenII Rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies against CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td>biolegend inc</td>
			<td>102215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>AC2-4S8-CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0461-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0900-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>L500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondrogenesis differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet Staining Solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magzol reagent(Trizol reagent)</td>
			<td>Magen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteogenic differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Kit</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td>RR036A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickBlock Blocking Buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR1 Premix</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats

ここでは、実験要件に対して多数の高品質細胞を迅速に得るために、インビトロで下顎骨髄間葉系幹細胞(mBMSC)を単離・培養するための効率的な方法を紹介します。mBMSCは、優れた自己再生能力と多系統分化能力により、将来的に頭蓋顔面疾患や頭蓋顎顔面再生の場合の組織工学細胞としての治療用途に広く使用される可能性があります。したがって、mBMSCs を大量に取得することが重要です。
本研究では、骨髄を下顎骨から洗い流し、原発mBMSCを骨髄付着栽培全体で単離した。さらに、CD29+CD90+CD45−mBMSCを蛍光細胞選別により精製した。第2世代の精製mBMSCは、骨芽細胞、有形細胞、軟骨細胞への分化においてさらなる研究と潜在能力を示す目的で使用された。このin vitroモデルを利用して、多くの増殖性mBMSCsを得ることができ、生物学的特性の研究、その後の微小環境への反応、およびmBMSCsの他の用途を促進することができる。

このプロトコルを用いて、初期培養後3日目にプレートに接着した細胞の大部分を占めた。典型的には、さらに3〜4日間培養した後、細胞合流率は70〜80%に達した(図1B)。蛍光細胞選別では、DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSCを精製して18,22、P0細胞で約81.1%を占めた(図1C)。
<p class="jove_c...

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Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

本稿では、ラット下顎骨から骨髄間葉幹細胞を単離、栽培、選別、同定するための骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせた方法を紹介する。

ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

isolation-cultivation-mandibular-bone-marrow-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K ビュー.  National Clinical Research center of Stomatology. 本稿では、ラット下顎骨から骨髄間葉幹細胞を単離、栽培、選別、同定するための骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせた方法を紹介する。

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

医学

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

急性白血病の治療のためのチロシンキナーゼ阻害剤の前臨床評価

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

ラット心筋細胞の分離と培養

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result from altered activity of cells responsible for enamel synthesis named ameloblasts, which present in enamel organ. During amelogenesis, ameloblasts follow a specific and precise sequence of events of proliferation, differentiation, and death. A rat continually growing incisors is a suitable experimental model to study ameloblast activity and differentiation stages in physiological and pathological conditions. Here, we describe a reliable and consistent method to micro-dissect enamel organ of rats exposed to environmental toxicants. The micro-dissected dental epithelia contain secretion- and maturation-stage ameloblasts that may be used for qualitative experiments, such as immunohistochemistry assays and in situ hybridization, as well as for quantitative analyses such as RT-qPCR, RNA-seq, and Western blotting.

Understanding enamel formation and possible alterations requires the study of ameloblast activity. Here, we describe a reliable and consistent method to micro-dissect enamel organs containing secretion- and maturation-stage ameloblasts that may be used for further quantitative and qualitative experimental procedures.

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.