Agradecemos la asistencia del Laboratorio de Estomatología Digitalizada y el Centro de Investigación de Anomalías Craneofaciales del Noveno Hospital Popular de Shanghai. El trabajo de este manuscrito está respaldado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, el fondo SHIPM-mu del Instituto de Medicina de Precisión de Shanghai, el Noveno Hospital Popular de Shanghai, la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai [JC201809], el Proyecto de Incentivo del Equipo de Innovación de Alto Nivel para la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai. Y L.J. es un académico de los Talentos Médicos Juveniles Sobresalientes, el Programa de Desarrollo Juvenil "Rising Stars of Medical Talent" de Shanghai y el proyecto "Chen Xing" de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

Todos los procedimientos experimentales en animales en este documento fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal del Noveno Hospital Popular de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai.
1. Preparación
<ol><li>Use dos ratas Sprague Dawley machos de 5 semanas de edad para el experimento.</li>
	<li>Esterilizar todos los instrumentos, incluyendo porta agujas, pinzas y tijeras a alta temperatura o sumergidos en etanol al 75% durante 10 min. NOTA: La inmersión en etanol no debe ser demasiado larga para evitar el daño celular.</li>
	<li>Preparar previamente los medios de cultivo, cuya composición figura en el cuadro 1. Complemente cada medio como se describe a continuación.<ol>
<li>Preparación del medio de cultivo α-MEM (con 10% de FBS): Complementar el medio mínimo esencial alfa (α-MEM) con suero fetal bovino al 10% y al 1% de penicilina y estreptomicina.</li>
		<li>Preparación del medio de diferenciación osteogénico: Suplemento de diferenciación osteogénica del medio basal con suero bovino fetal al 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, ácido ascórbico al 0,20%, 1% β-glicerofosfato y dexametasona al 0,01%.</li>
		<li>Preparación de medio de inducción osteogénico: Mezclar 70% α-MEM medio de cultivo (con 10% FBS) y 30% medio de diferenciación osteogénica.</li>
		<li>Preparación del medio de diferenciación adipogénico A: Complementar el medio basal de diferenciación adipógena con suero fetal bovino al 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 0,20% insulina, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazona y 0,01% Dexametasona.</li>
		<li>Preparación del medio de diferenciación adipogénico B: complementar la diferenciación adipógena del medio basal con suero fetal bovino al 10%, glutamina al 1%, penicilina-estreptomicina al 1% e insulina al 0,20%.</li>
		<li>Preparación del medio de diferenciación condrógena: Suplemento de diferenciación condrogénica del medio basal con 0,01% de dexametasona, 0,30% de ácido ascórbico, 1% its, 0,10% de piruvato de sodio, 0,10% de prolina y 1% de TGF-β3. NOTA: El medio de diferenciación osteogénica debe utilizarse dentro de un mes después de la configuración. El período efectivo del medio de diferenciación condrogénica configurado es de 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Aislamiento y cultivo de mBMSCs de rata
NOTA: Todas las operaciones experimentales deben realizarse en hielo tanto como sea posible para mantener la viabilidad celular.
<ol><li>Cosecha de mandíbulas de rata<ol>
<li>Euthanize dos ratas masculinas de 5 semanas sprague Dawley por la asfixia delCO2. Asegúrese de que la respiración del animal se detiene antes de continuar con el experimento.</li>
		<li>Enjuague estas ratas en un casto que contenga etanol al 75% durante 3 min.</li>
		<li>Coloque la rata dentro de una campana extractora de humos limpia para cosechar mandíbulas. NOTA: Esterilice la campana extractora de humos mediante radiación de luz ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso.</li>
		<li>Coloque a la rata en decúbito supino. Incise las pieles y los músculos buccinadores de los oris bilaterales del angulus a la región posterior de la mandíbula, que es el único hueso móvil con la incisivo más baja. NOTA: Se recomienda hacer una incisión de 2 cm a cada lado del oris angulus para obtener un campo de operación claro.</li>
		<li>Abra la boca de la rata empujando los incisivos maxilares y mandibulares hacia la dirección opuesta con ambos pulgares para exponer los dientes mandibulares, que están unidos a la mandíbula.</li>
		<li>Desconecte completamente los músculos bucales y los tendones unidos a los coracoides y el borde inferior de la mandíbula. NOTA: Se observa una mayor movilidad de la mandíbula durante este paso debido a la falta de tensión muscular.</li>
		<li>Presione los dientes posteriores mandibulares y gire hacia atrás y hacia abajo hasta que los cóndilos en ambos lados estén claramente expuestos. NOTA: Este paso se realiza para abrir artificialmente la boca de la rata en la máxima medida posible para dislocar el cóndilo. La mandíbula está conectada al cráneo a través de cóndilos bilaterales, por lo que la exposición de los cóndilos conduce a la desconexión entre el cráneo y la mandíbula.</li>
		<li>Separe el cuerpo de la mandíbula del cráneo.</li>
		<li>Limpie el tejido blando adherente en la superficie ósea con una gasa húmeda.</li>
		<li>Coloque el hueso en un plato de vidrio estéril de 10 cm lleno de α medio esencial mínimo preenfriado (α-MEM) o solución salina tampón de fosfato (PBS) sobre hielo para preservar la viabilidad.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento y cultivo de los mBMSCs<ol>
<li>Cortar el hueso anterior a lo largo del borde mesial del primer molar del cuerpo mandibular. Retire el ramo mandibular incluyendo el coracoides y el cóndilo a lo largo del borde distal del tercer molar para exponer la cavidad de la médula.</li>
		<li>Llene un plato de vidrio estéril de 10 cm con 10 mL de α-MEM (con 10% de FBS).</li>
		<li>Use jeringa de 1 ml para aspirar α-MEM. Con la aguja de la jeringa insertada en la cavidad de la médula ósea, enjuague repetidamente la médula ósea en el plato. Enjuague la cavidad ósea al menos 3 veces desde los lados mesial y distal del hueso, respectivamente, hasta que el hueso se volviera blanco. NOTA: Este es el paso más crítico, ya que la cavidad de la médula ósea de una mandíbula de rata no es tan obvia como en el hueso largo y el punto adecuado para insertar la aguja debe determinarse empíricamente. Todas las muestras experimentales anteriores deben almacenarse en hielo para mantener la viabilidad de la célula y, por lo tanto, el tiempo de operación no debe ser superior a 2 h.</li>
		<li>Transfiera el medio que contiene las células enjuagadas a un tubo centrífuga de 15 mL y la centrífuga a 800 x g en 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspend las células con 3 mL de α-MEM (con FBS del 10%). Platear las células en un nuevo plato de cultivo de 10 cm e incubar a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%.</li>
		<li>Compruebe los cambios morfológicos y el crecimiento de estas células en el 3er día de cultivo. Retire el medio de cultivo con células no acomodantes y fragmentos de tejido. Agregue suavemente 10 mL de α-MEM fresco (con 10% de FBS).</li>
		<li>Después de 7 días de cultivo, P0 mBMSCs alcanzó 70% a 80% de confluencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Ordenación de celdas de flujo NOTA: P0 mBMSCs fueron identificados fenotípicamente y purificados sobre todo con la clasificación de la célula del flujo.<ol>
<li>Aspirar y desechar el medio de cultivo y luego lavar el plato con PBS. Descarte el PBS.</li>
		<li>Añadir 1 mL de tripsina al 0,25% con EDTA al 0,02% en el plato. Digiera las células a 37 °C durante 5 min, luego agregue 2 mL de α-MEM (con 10% de FBS) para detener la reacción.</li>
		<li>Transfiera la suspensión de las células a un tubo centrífuga de 15 mL y la centrífuga a 800 x g durante 5 min.</li>
		<li>Resuspend las células en 120 μL de PBS (con el 10% FBS) después de la centrifugación.</li>
		<li>Bloquee estas suspensiones celulares con 1 μL de anticuerpo contra CD16/CD32 a 4 °C durante 15 min.</li>
		<li>Transferir 100 μL de la suspensión celular en un nuevo tubo de microcentrífuga, teñir las células con Ficoeritrina (PE)-anticuerpo conjugado contra CD45, fluoresceína-isotiocianato (FITC)-anticuerpo conjugado contra CD90 y Aloficianina (APC)-anticuerpo contra CD29 a 4 °C durante 1 h en la oscuridad13,15. La concentración de anticuerpos utilizados en este experimento se muestra en la Tabla 2. Utilice los otros 20 μL de suspensión celular como control negativo no manchado.</li>
		<li>Luego centrifugar los tubos a 800 x g durante 5 min, desechar la suspensión y resuspensar las células en 0.5 mL de PBS (con 10% de FBS).</li>
		<li>Añadir 10 μL de 0,01 mg/mL DAPI durante 10 min antes del análisis.</li>
		<li>Utilice filtros de 40 nm colocados en tubos centrífugos para filtrar las células.</li>
		<li>Analice las células en el clasificador de células activado por fluorescencia. Establezca los paneles de la siguiente manera. En primer lugar, eliminar las células muertas de la cuenta celular total por gating DAPI- células, a continuación, puerta CD29+CD90+CD45- en las células seleccionadas como mBMSCs dirigidos.</li>
		<li>Recoja las células CD29+CD90+CD45- clasificadas en un tubo de centrífuga de 15 mL con 3 mL de α-MEM (con 10% de FBS) pre-preparado.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 800 x g durante 5 min. Quite el buffer de la colección y agregue 1 mL de α-MEM fresco (con el 10% FBS) para resuspend las células. Luego plaéalos en un plato de cultivo de 6 cm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Capacidad de formación de colonias
NOTA: Este paso se realizó para comprobar la capacidad de división de mBMSC. 15.
<ol><li>Seleccione los mBMSCs del segundo paso (P2) para este experimento. Cuando la confluencia celular alcanzó del 80% al 90%, reseseed las células en un gradiente serial en una placa de 6 pozos para evaluar su capacidad clonal de proliferación. NOTA: Se recomienda establecer el gradiente de 1 x 102 a 1 x 103 células por pocillo, pero las diluciones finales de diferentes líneas celulares de origen humano o animal se determinaron empíricamente.</li>
	<li>Cultíe las células en α-MEM (con el 10% FBS) por aproximadamente dos semanas hasta que un buen número de las unidades formantes de la colonia se pudieran considerar bajo microscopio ligero. Actualice el medio de cultivo cada 3 días.</li>
	<li>Aspirar y desechar el medio de cultivo, lavar los pozos con PBS dos veces durante 5 min a la vez. A continuación, agregue la solución de paraformaaldehído al 4% a cada pozo y arregle durante al menos 10 min.</li>
	<li>Retire el paraformalido y enjuague los pozos dos veces con PBS.</li>
	<li>Manche las células con una solución de tinción de violeta cristalina e incubarlas en 37 °C durante aproximadamente 10 min. NOTA: El tiempo de tinción se ajustó adecuadamente hasta que se logre la sombra deseada.</li>
	<li>Retire la solución de tinción y lave las muestras con agua destilada para detener la reacción.</li>
	<li>Imagen bajo un estereomicroscopio y recuento de colonias celulares dispersas que consistían en al menos 50 células.</li>
</ol>4. Diferenciación multilínea de mBMSCs
NOTA: Los mBMSCs P2 se utilizaron para experimentos posteriores a menos que se describa lo contrario.
<ol><li>Inducción osteogénica de mBMSCs<ol>
<li>Digiera los mBMSCs como se describió arriba. Células de semilla a una densidad de 2,5 x 105/cm2 en una placa de 12 pozos suplementada con 1 mL α-MEM (con 10% de FBS).</li>
		<li>Cuando la confluencia celular alcanzó el 60-70%, cambie el medio en medios de inducción osteogénica al 30%. Cultíe las células con α-MEM (con FBS al 10%) como control negativo y cambie el medio cada 2 días. NOTA: Después de que un gran buen número de nódulos de calcio aparezcan durante la osteogénesis, se recomienda cambiar el patrón de intercambio medio a un intercambio medio de medio volumen cada 2 días, para evitar que los osteoblastos flote.</li>
		<li>Después de cultivar durante siete días, evaluar la calcificación de estas células por la fosfatasa alcalina tinción16,17.</li>
		<li>Retire el medio de cultivo y fije las células con paraformadehído al 4% durante 10 min. Enjuague las células usando 1 mL de PBS por pozo durante 3 min dos veces.</li>
		<li>A continuación, mantejen las células con solución de tinción de fosfatasa alcalina e incuben a 37 °C durante 10-30 min. NOTA: La incubación se puede realizar durante la noche a temperatura ambiente para obtener el color requerido.</li>
		<li>Lave los pozos con agua destilada para detener la reacción. Tome fotografías bajo microscopio de luz. Los gránulos pigmentados rojos representan actividad de la fosfatasa alcalina (MONTAN@A).</li>
		<li>Después de cultivar las células restantes durante otros 7 días, realice la tinción de alizarina en rojo para evaluar la capacidad de mineralización de las células.</li>
		<li>Manteje las células con una solución de tinción de alizarina al 0,5% después de la fijación celular durante 10 min16,18. Detener la reacción cromógena con agua destilada después de 3-5 min. NOTA: El tiempo de reacción se puede ampliar dependiendo del color desarrollado.</li>
		<li>Finalmente, coloque la placa de cultivo debajo del microscopio de luz para observar el efecto de la tinción osteogénica; los nódulos rojos indican los depósitos del calcio de estas células.</li>
	</ol></li>
	<li>Inducción adipógena de mBMSCs<ol>
<li>Semilla P2 mBMSCs en una placa de 12 pozos como se describió anteriormente.</li>
		<li>Después de que el pozo se convierta en 90% confluente, cultivo de las células con medio de diferenciación adipogénico A. Utilice células cultivadas en α-MEM medio de cultivo (con 10% FBS) como control negativo.</li>
		<li>Después de 2 días de inducción, aspirar el medio A del pozo y añadir 1 mL de medio de diferenciación adipógena B en cada pozo.</li>
		<li>Después de un día, retire el medio B y comience el ciclo de nuevo con el medio A añadido de nuevo en el pozo. Cultíe las células alternativamente usando los medios A y B.</li>
		<li>Aplicar el medio de diferenciación A y B alternativamente durante tres ciclos y detectar la adipogénesis de estas células mediante aceite rojo O tinción16,18. NOTA: Un montón de gotitas de lípidos redondos y grandes se pueden observar mediante el cultivo de estas células con el medio de diferenciación B durante un adicional de 2 a 3 días.</li>
		<li>Retire el medio y fije las células con paraformadehído al 4% durante 10 min. Lave las células con PBS.</li>
		<li>Manteje las células con la solución de tinción de O de color rojo aceite e incube a 37 °C durante aproximadamente 3 min.</li>
		<li>Retire la solución de tinción y lave los pozos con agua destilada.</li>
		<li>Observe la adipogénesis bajo microscopio de luz.</li>
	</ol></li>
	<li>Inducción de la condrogénesis de mBMSCs<ol>
<li>Semilla P2 mBMSCs en tubo centrífugo de 15 mL a una densidad de 5 x 105/cm2.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspend las células con 0,5 mL de medio de diferenciación condrogénica. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min.</li>
		<li>Afloje la tapa del tubo de la centrífuga e incube a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%. Renueve el medio cada 2 días. NOTA: Las células comienzan a peletizar después de 24 h. Se recomienda no mover el tubo de la centrífuga durante 48 h. Tenga cuidado de no aspirar el pellet celular al cambiar el medio.</li>
		<li>Después de 21 días de inducción, fije los pellets celulares con paraformadehído al 4%, seguido de deshidratación, incrustación de parafina y seccionamiento.</li>
		<li>Después de la desparafinación e hidratación, manche los portaobjetos en solución azul alciano durante al menos 15 min18,19,20,21,luego lave con agua destilada para detener la reacción. Captura las fotografías bajo microscopio de luz.</li>
		<li>Para la tinción inmunofluorescente de colágeno tipo II, realice los pasos a continuación.<ol>
<li>Incubar los portaobjetos con 5 μg/mL de proteinasa K durante 15 min a 37 °C después de la etapa de desparafinación e hidratación.</li>
			<li>Incubar los portaobjetos en tampón de bloqueo durante 1 h a 37 °C.</li>
			<li>Aplicar 1 μL de colágeno tipo II anticuerpo en 200 μL de tampón de bloqueo a los portaobjetos e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
			<li>Al día siguiente, lave los portaobjetos con PBS dos veces e incube con anticuerpos secundarios a 37 °C durante 1 h.</li>
			<li>Incubar las rodajas con 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tome fotografías de cada diapositiva bajo microscopia de fluorescencia.</li>
	</ol></li>
</ol>5. PCR en tiempo real
<ol><li>Extraiga el ARN total de mBMSCs usando un reactivo disponible comercialmente basado en el isotiocianato de guanidium.</li>
	<li>Realice la transcripción reversa del ARN en la DNA complementaria usando un kit comercialmente disponible. Las condiciones de reacción de la transcripción inversa fueron las siguientes: 65 °C durante 5 min, 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 15 s.</li>
	<li>Realizar PCR en tiempo real para detectar genes específicos de osteogénesis y adipogénesis utilizando cebadores listados en la Tabla 3. El procedimiento de amplificación por PCR fue el siguiente: 95 °C durante 5 min. 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s durante 40 ciclos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+education+for+medical+students+at+Tongji+University:+Primary+cell+culture+and+directional+differentiation+of+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).</li><li>Chu, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+under+Controllable+Serum-Free+Conditions.">Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).</li><li>Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+the+WNT-Signaling+Modulators+BIO+and+PKF118-310+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).</li><li>Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Chondrogenic+Differentiation+Potential+of+Equine+Synovial+Membrane-Derived+and+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).</li><li>Li, X., Zhang, Y., Qi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+isolation+methods+and+culture+conditions+for+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).</li><li>Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+(bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells)+for+bone+tissue+engineering:+basic+science+to+clinical+translation.">Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal(mesenchymal)+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture.">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).</li></ol>

Todos los autores afirman que no tienen conflictos de intereses.

Este protocolo describe un método para aislar BMSCs de mandíbulas de la rata in vitro combinando adherencia entera de la médula y la clasificación fluorescente de la célula, que es una manera simple y confiable de obtener mBMSCs proliferativos con capacidad fuerte de la diferenciación. Este método podría purificar preliminarmente mBMSCs por la clasificación de células de flujo, pero si hay requisitos más altos para la homogeneidad celular, se pueden requerir métodos de purificación más precisos.
<p clas...

Las células madre mesenquimales de médula ósea (BMSCs) son células madre no hematopoyéticas derivadas de la médula ósea que manifiestan una fuerte capacidad de proliferación y un potencial de diferenciación de múltipleslinajes 1,2,3,4. De hecho, los BMSCs han sido considerados como un candidato ideal para la ingeniería y regeneración de tejidos óseos desde que fueron descubiertos. Durante años, la cresta ilíaca o los huesos largos como la tibia y el fémur han sido la fuente más común de BMSCs para la regeneración craneofacial. Sin embargo, los BMSCs orofaciales, como los BMSCs de la mandíbula (mBMSCs), muestran algunas diferencias de los BMSCs de hueso largo, como el origen embrionario diferente y el patrón de desarrollo. Las mandíbulas surgen de las células neurales de la cresta de la capa germinal del neuroectodermo y se someten a la osificación intramembranosa, mientras que los esqueletos axiales y apendiculares son del mesodermo y se someten a la osificación endocondral. Además, las observaciones clínicas y los estudios experimentales en animales han indicado consistentemente que existen diferencias funcionales entre la cresta orofacial e ilíaca BMSCs5,6,7,8. Los informes han demostrado que los BMSCs derivados del hueso craneofacial, como la mandíbula, el hueso maxilar y el hueso alveolar, exhibieron una proliferación, una vida y una capacidad de diferenciación superiores a las de los huesos axiales y apendiculares9. Los mBMSCs, por lo tanto, se consideran los recursos preferidos para futuras aplicaciones terapéuticas de enfermedades craneofaciales como el querubismo, el tumor de mandíbula, la osteoporosis del hueso de la mandíbula y el defecto del tejido periodontal10,11,12. Para entender el potencial del tratamiento en experimentos preclínicos, es esencial establecer un método para aislar y cultivar rápidamente mBMSCs in vitro.
En este estudio, el objetivo fue obtener mBMSCs purificados por adherencia de médula ósea entera y clasificación por citometría de flujo. La morfología anatómica de la mandíbula de la rata, observada claramente con la tomografía computada micro (Micro-CT) y las secciones histológicas, demostró que el hueso trabecular de la mandíbula estaba entre el espacio medular de la incisivo y el hueso alveolar. La médula ósea del hueso trabecular se enjuagaba para obtener células de médula mandibular, pero las células cultivadas de esta manera no eran mBMSCs puros y eran susceptibles de consistir en múltiples tipos de células con potencias inciertas y diversos linajes como células de células óseas, grasas y endoteliales13,14. El siguiente paso de la purificación celular fue particularmente importante. La citometría de flujo filtra las células mediante el reconocimiento de una combinación de proteínas de la superficie celular y ha sido ampliamente adoptada en el enriquecimiento de las células madre mesenquimales. La homogeneidad celular es la principal ventaja de la citometría de flujo, pero el proceso no determina la viabilidad celular y puede resultar en un rendimiento celular limitado. En este estudio, los mBMSCs P0 obtenidos de la adherencia entera de la médula fueron clasificados por cytometry de flujo para obtener los mBMSCs con alta pureza y capacidad fuerte de la proliferación.
Este estudio introduce un protocolo reproducible y confiable para el aislamiento, la cultura, y la diferenciación de la mandíbula BMSCs de la rata usando una combinación de adherencia entera de la médula y de la clasificación cytometry de flujo. Es un método confiable y conveniente para que los investigadores en campos relacionados lo usen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acutenaculum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipogenic differentiation medium</td>
			<td>Cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-Minimum essential medium</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30265.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -CollagenII Rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies against CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td>biolegend inc</td>
			<td>102215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>AC2-4S8-CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0461-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0900-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>L500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondrogenesis differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet Staining Solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magzol reagent(Trizol reagent)</td>
			<td>Magen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteogenic differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Kit</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td>RR036A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickBlock Blocking Buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR1 Premix</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats

Aquí presentamos un método eficiente para aislar y cultivar células madre mesenquimales de médula ósea mandibular (mBMSCs) in vitro para obtener rápidamente numerosas células de alta calidad para los requisitos experimentales. Los mBMSCs podrían ser ampliamente utilizados en aplicaciones terapéuticas como células de ingeniería de tejidos en caso de enfermedades craneofaciales y regeneración craneo-maxilofacial en el futuro debido a la excelente capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación multi-linaje. Por lo tanto, es importante obtener mBMSCs en grandes cantidades.
En este estudio, la médula fue limpiada con un chorro de agua de la mandíbula y los mBMSCs primarios fueron aislados con la cultivación adherente entera de la médula. Además, CD29+CD90+CD45− mBMSCs fueron purificados a través de la clasificación de células fluorescentes. La segunda generación de mBMSCs purificados fue utilizada para el estudio adicional y exhibió potencial en el distinción en osteoblasts, adipocytes, y chondrocytes. Utilizando este modelo in vitro, se puede obtener un alto número de mBMSCs proliferativos, lo que puede facilitar el estudio de las características biológicas, la reacción posterior al microambiente y otras aplicaciones de los mBMSCs.

Usando este protocolo, una gran proporción de células se adhirieron a la placa en el tercer día después de la cultura inicial. Típicamente, después de 3-4 días adicionales de cultivo, la confluencia celular alcanzó el 70-80% (Figura 1B). Con la clasificación de células fluorescentes, dapi-CD29+CD90+CD45− mBMSCs fueron purificados18,22, que representaron alrededor del 81,1% en la...

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Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.

Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

isolation-cultivation-mandibular-bone-marrow-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K vistas.  National Clinical Research center of Stomatology. Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Investigación

Medicina

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

En vivo de imágenes y Seguimiento de tecnecio-99m Etiquetada células madre mesenquimales de médula ósea en Equinos tendinopatía

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

Un método libre de enzimas para el aislamiento y la expansión de las células madre mesenquimales derivadas de adiposo humano

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia (BPD). In premature infants, BPD is a major complication despite early use of surfactant therapy, optimal ventilation strategies, and noninvasive positive pressure ventilation. Because pulmonary inflammation plays a crucial role in the pathogenesis of BPD, corticosteroid use is one potential treatment to prevent it. Nevertheless, systemic corticosteroid treatment is not usually recommended for preterm infants due to long-term adverse effects. Preclinical studies and human phase I clinical trials demonstrated that use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in hyperoxia-induced lung injuries and in preterm infants is safe and feasible. Intratracheal and intravenous MSC transplantation has been shown to protect against neonatal hyperoxic lung injury. Therefore, intratracheal administration of stem cells and combined surfactant and glucocorticoid treatment has emerged as a new strategy to treat newborns with respiratory disorders. The developmental stage of rat lungs at birth is equivalent to that in human lungs at 26&#8722;28 week of gestation. Hence, newborn rats are appropriate for studying intratracheal administration to preterm infants with respiratory distress to evaluate its efficacy. This intratracheal instillation technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into the lungs.

Described is a protocol for performing intratracheal transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs) through intratracheal injection in term neonatal rats. This technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into neonatal rat lungs to evaluate their efficacy.

Instilación intratraqueal de células madre en ratas neonatales a término

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...