Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Kraniyofasiyal Anomaliler Için Dijitalleştirilmiş Stomatoloji ve Araştırma Merkezi Laboratuvarı'nın yardımı için teşekkür ederiz. Bu makalenin çalışmaları Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (NSFC) hibeleriyle desteklenmektedir [81570950,81870740,81800949], Şanghay Zirvesi & Plato Disiplinleri, Şanghay Hassas Tıp Enstitüsü'nden SHIPM-mu fonu, Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi [JC201809], Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi için Üst Düzey İnovasyon Ekibinin Teşvik Projesi. Ve L.J. Üstün Gençlik Tıbbi Yetenekleri, Şanghay "Tıbbi Yeteneğin Yükselen Yıldızları" Gençlik Geliştirme Programı ve Şanghay Jiaotong Üniversitesi'nden "Chen Xing" projesinin bir bilginidir.

Bu makaledeki tüm hayvan deneysel prosedürleri Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hazırlık
<ol><li>Deney için 5 haftalık iki erkek Sprague Dawley faresi kullanın.</li>
	<li>İğne tutucular, cımbızlar ve makaslar da dahil olmak üzere tüm aletleri yüksek sıcaklıkta sterilize edin veya 10 dakika boyunca% 75 etanol içine daldırın. NOT: Etanol daldırma hücre hasarlarını önlemek için çok uzun olmamalıdır.</li>
	<li>Kompozisyonu Tablo 1'desağlanan kültür medyasını önceden hazırlayın. Aşağıda açıklandığı gibi her ortamı tamamlayın.<ol>
<li>α-MEM kültür ortamının hazırlanması (%10 FBS ile): %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin ve streptomisin ile minimum esansiyel orta alfayı (α-MEM) tamamlar.</li>
		<li>Osteojenik farklılaşma ortamının hazırlanması: %10 fetal sığır serumu, %1 glutamin, %1 penisilin-streptomisin, %0,20 askorbik asit, %1 β-glisefosfat ve %0,01 deksametazon ile takviye osteojenik farklılaşma bazal ortamı.</li>
		<li>Osteojenik indüksiyon ortamının hazırlanması: %70 α-MEM kültür ortamını (%10 FBS ile) ve %30 osteojenik farklılaşma ortamını karıştırın.</li>
		<li>Adipojenik farklılaşma ortamının hazırlanması A: %10 fetal sığır serumu, %1 glutamin, %1 penisilin-streptomisin, %0,20 insülin, %0,10 IBMX, %0,10 Rosiglitazone ve %0,01 Dexamethasone ile takviye adipojenik farklılaşma bazal ortamı.</li>
		<li>Adipojenik farklılaşma ortamı B'nin hazırlanması: %10 fetal sığır serumu, %1 glutamin, %1 penisilin-streptomisi ve %0,20 insülin ile takviye adipojenik farklılaşma bazal ortamı.</li>
		<li>Kondrojenik farklılaşma ortamının hazırlanması: %0.01 Deksametazon, %0.30 Askorbik asit, %1 ITS, %0.10 Sodyum piruvat, %0.10 Prolin ve %1 TGF-β3 ile ek kondrojenik farklılaşma bazal ortamı. NOT: Osteojenik farklılaşma ortamı yapılandırmadan sonraki bir ay içinde kullanılmalıdır. Yapılandırılmış kondrojenik farklılaşma ortamının etkili süresi 12 saattir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sıçan mBMSC'lerin izolasyonu ve yetiştirilmesi
NOT: Hücre canlılığını korumak için tüm deneysel işlemler mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır.
<ol><li>Sıçan mandibulalarının toplanması<ol>
<li>CO2 boğulması ile 5 haftalık iki erkek Sprague Dawley sıçanını ötenazi edin. Deneye devam etmeden önce hayvanın solunumun kesildiğinden emin olun.</li>
		<li>Bu sıçanları 3 dakika boyunca% 75 etanol içeren bir beherde durulayın.</li>
		<li>Fareyi mandibulaları hasat etmek için temiz bir duman kaputunun içine yerleştirin. NOT: Duman davlumbazını kullanmadan önce 30 dakika boyunca ultraviyole ışık radyasyonu ile sterilize edin.</li>
		<li>Sıçanı bir supine pozisyonuna getirin. Derileri ve buccinator kaslarını bilateral angulus oris'ten alt kesici dişe sahip tek hareketli kemik olan mandibulanın arka bölgesine kadar inkübize edin. NOT: Net bir çalışma alanı elde etmek için angulus oris'in her iki tarafında 2 cm'lik bir kesi yapılması önerilir.</li>
		<li>Mandibulaya tutturulmuş mandibular dişleri ortaya çıkarmak için maksiller ve mandibuler kesici dişleri her iki başparmakla ters yöne doğru iterek sıçanın ağzını açın.</li>
		<li>Bukuzal kasları ve koracoidlere bağlı tendonları ve mandibulanın alt sınırını tamamen çıkarın. NOT: Bu adım sırasında kas gerginliği olmaması nedeniyle mandibula hareketliliğinde artış gözlenir.</li>
		<li>Mandibular arka dişlere basın ve her iki taraftaki kondyles açıkça açığa çıkana kadar geriye ve aşağı doğru döndürün. NOT: Bu adım, sıçanın ağzını, kondyle'u yerinden çıkarmak için mümkün olan en yüksek ölçüde yapay olarak açmak için gerçekleştirilir. Mandibula, çift kondyles yoluyla kafatasına bağlanır, bu nedenle kondilenlerin maruz kalması kafatası ile mandibula arasındaki kopukluğa yol açar.</li>
		<li>Mandibula vücudunu kafatasından ayırın.</li>
		<li>Kemik yüzeyindeki yapışan yumuşak dokuyu ıslak bir gazlı bez kullanarak temizleyin.</li>
		<li>Canlılığı korumak için kemiği buzun üzerine önceden sarılmış minimum esansiyel orta α (α-MEM) veya fosfat tampon salin (PBS) ile dolu 10 cm steril bir cam kabın içine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC'lerin izolasyonu ve yetiştirilmesi<ol>
<li>Mandibular gövdeden ilk azı dişinin mesial kenarı boyunca ön kemiği kesin. İlik boşluğunu ortaya çıkarmak için üçüncü azı dişinin distal kenarı boyunca coracoid ve kondyle dahil olmak üzere mandibular ramus'u çıkarın.</li>
		<li>10 cm steril cam kabı 10 mL α-MEM (%10 FBS ile) ile doldurun.</li>
		<li>α-MEM kültür ortamını aspire etmek için 1 mL şırınna kullanın. Kemik iliği boşluğuna sokulmuş şırınga iğnesi ile kemik iliğini tekrar tekrar çanağa yıkayın. Kemik boşluğunu, kemik beyazlayıncaya kadar sırasıyla kemiğin hem mesial hem de distal yanlarından en az 3 kez yıkayın. NOT: Bu en kritik adımdır, çünkü bir sıçan mandibulasının kemik iliği boşluğu uzun kemikteki kadar belirgin değildir ve iğneyi yerleştirmek için uygun noktanın ampirik olarak belirlenmesi gerekir. Yukarıdaki tüm deneysel örnekler hücre canlılığını korumak için buz üzerinde depolanmalıdır ve bu nedenle çalışma süresi 2 saatten uzun olmamalıdır.</li>
		<li>Yıkanmış hücreleri içeren ortamı 15 mL santrifüj tüpüne ve 4 °C'de 800 x g'da santrifüje 5 dakika aktarın. Üstnatant atın.</li>
		<li>Hücreleri 3 mL α-MEM (%10 FBS ile) ile yeniden biriktirin. Hücreleri yeni bir 10 cm kültür çanakta plakalayın ve% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Kültürün 3. gününde bu hücrelerin morfolojik değişimlerini ve büyümesini kontrol edin. Doğal olmayan hücreler ve doku parçaları ile kültür ortamını çıkarın. Hafifçe 10 mL taze α-MEM ekleyin (%10 FBS ile).</li>
		<li>7 günlük kültürden sonra, P0 mBMSC'ler% 70 ila% 80 birışıklığa ulaştı.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış hücresi sıralama NOT: P0 mBMSC'ler fenotipik olarak tanımlandı ve öncelikle akış hücresi sıralama yoluyla saflaştırıldı.<ol>
<li>Kültür ortamını aspire edin ve atın ve ardından yemeği PBS ile yıkayın. PBS'yi atın.</li>
		<li>Yemeğe % 0.02 EDTA ile% 0.25 trypsin 1 mL ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 5 dakika sindirin, ardından reaksiyonun durdurulması için 2 mL α-MEM (%10 FBS ile) ekleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne ve 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüje aktarın.</li>
		<li>Santrifüjlemeden sonra hücreleri 120 μL PBS'de (%10 FBS ile) yeniden biriktirin.</li>
		<li>Bu hücre süspansiyonlarını 15 dakika boyunca 4 °C'de CD16/CD32'ye karşı 1 μL antikorla engelleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik kısmını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, CD45'e karşı Phycoerythrin (PE)-konjuge antikor, CD90'a karşı floresan-izotiyosiyanat (FITC) ve 4 °C'de 1 saat boyunca CD29'a karşı Allophycocyanin (APC)-antikoru ile hücreleri lekeleyin13,15. Bu deneyde kullanılan antikorların konsantrasyonu Tablo 2'de gösterilmiştir. Diğer 20 μL hücre süspansiyonu lekesiz negatif kontrol olarak kullanın.</li>
		<li>Daha sonra tüpleri 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj edin, süspansiyonu atın ve hücreleri 0,5 mL PBS'de (%10 FBS ile) yeniden biriktirin.</li>
		<li>Analizden önce 10 dakika boyunca 10 μL 0,01 mg/mL DAPI ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri filtrelemek için santrifüj tüplerine yerleştirilen 40 nm filtreleri kullanın.</li>
		<li>Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralayıcısı üzerindeki hücreleri analiz edin. Panelleri aşağıdaki gibi ayarlayın. İlk olarak, seçilen hücrelerde HEDEFLENEN mBMSC'ler olarak DAPI- hücreler, ardından cd29+CD90+CD45kapısı - gating yaparak ölü hücreleri toplam hücre sayısına çıkarın.</li>
		<li>Sıralanmış CD29+CD90+CD45- hücreleri önceden hazırlanmış 3 mL α-MEM (% 10 FBS ile) ile 15 mL santrifüj tüpünde toplayın.</li>
		<li>Tüpleri 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj edin. Toplama arabelleği çıkarın ve hücreleri yeniden çıkarmak için 1 mL taze α-MEM (%10 FBS ile) ekleyin. Daha sonra 6 cm'lik bir kültür tabağında tabaklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Koloni oluşum yeteneği
NOT: Bu adım, mBMSC'lerin bölünme yeteneğini denetlemek için gerçekleştirildi. 15
<ol><li>Bu deneme için ikinci pasaj mBMSC'leri (P2) seçin. Hücre birleşmesi % 80 ila% 90'a ulaştığında, klonal çoğalma yeteneklerini değerlendirmek için hücreleri 6 kuyu plakasında bir seri gradyanda yeniden ekitledi. NOT: Degradenin kuyu başına 1 x 10 2 ila1 x 103 hücre arasında ayarlandırılması önerilir, ancak insan veya hayvan kökenli farklı hücre hatlarının son seyreltmeleri ampirik olarak belirlenmiştir.</li>
	<li>Α-MEM'deki hücreleri (%10 FBS ile) yaklaşık iki hafta boyunca, hafif mikroskop altında koloni oluşturan birimlerin çok sayıda görülebildiğine kadar kültüre edin. Kültür ortamını her 3 günde bir yenileyin.</li>
	<li>Kültür ortamını aspire edin ve atın, kuyuları PBS ile bir seferde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra her kuyuya% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve en az 10 dakika sabitleyin.</li>
	<li>Paraformaldehiti çıkarın ve kuyuları PBS ile iki kez durulayın.</li>
	<li>Hücreleri kristal mor boyama çözeltisi ile lekelayın ve yaklaşık 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Boyama süresi, istenen gölge elde edilene kadar uygun şekilde ayarlanır.</li>
	<li>Boyama çözeltisini çıkarın ve reaksiyonun durması için numuneleri damıtılmış suyla yıkayın.</li>
	<li>Stereomikroskop altında görüntü ve en az 50 hücreden oluşan dağınık hücre kolonilerini saymak.</li>
</ol>4. mBMSC'lerin çok satırlı farklılaşması
NOT: P2 mBMSC'ler, aksi belirtilmedikçe sonraki denemeler için kullanılmıştır.
<ol><li>mBMSC'lerin osteojenik indüksiyonu<ol>
<li>Yukarıda açıklandığı gibi mBMSC'leri özetle. 1 mL α-MEM(%10 FBS ile) ile desteklenmiş 12 kuyu plakasında 2,5 x 105/cm 2 yoğunlukta tohum hücreleri.</li>
		<li>Hücre birleşmesi % 60-70'e ulaştığında, ortamı% 30 osteojenik indüksiyon ortamına değiştirin. Hücreleri α-MEM (%10 FBS ile) negatif kontrol olarak kültüre edin ve ortamı her 2 günde bir değiştirin. NOT: Osteogenez sırasında çok sayıda kalsiyum nodül ortaya çıktıktan sonra, osteoblastların yüzmesini önlemek için orta değişim deseninin her 2 günde bir yarım hacimli orta değişime değiştirilmesi önerilir.</li>
		<li>Yedi gün boyunca kültlemeden sonra, bu hücrelerin kireçlenmesini alkali fosfataz lekeleme ile değerlendirin16,17.</li>
		<li>Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Hücreleri kuyu başına 1 mL PBS kullanarak iki kez 3 dakika durulayın.</li>
		<li>Daha sonra hücreleri alkali fosfataz boyama çözeltisi ile lekelenin ve 37 °C'de 10-30 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Gerekli rengi elde etmek için oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka yapılabilir.</li>
		<li>Reaksiyonun durdurulması için kuyuları damıtılmış suyla yıkayın. Işık mikroskobu altında fotoğraf çek. Kırmızı pigmentli granüller alkali fosfataz (ALP) aktivitesini temsil eder.</li>
		<li>Kalan hücreleri 7 gün daha kült ettikten sonra, hücrelerin mineralizasyon kapasitesini değerlendirmek için alizarin kırmızı lekeleme gerçekleştirin.</li>
		<li>Hücreleri 10 dk 16,18için hücre fiksasyonundan sonra% 0.5 alizarin kırmızı boyama çözeltisi ile lekelenin. Kromojenik reaksiyonun damıtılmış su ile 3-5 dakika sonra durdurulması. NOT: Reaksiyon süresi geliştirilen renge bağlı olarak uzatılabilir.</li>
		<li>Son olarak, osteojenik lekelemenin etkisini gözlemlemek için kültür plakasını ışık mikroskobu altına yerleştirin; kırmızı nodüller bu hücrelerin kalsiyum birikintilerini gösterir.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC'lerin adipojenik indüksiyonu<ol>
<li>Tohum P2 mBMSC'ler yukarıda açıklandığı gibi 12 kuyu plakasında.</li>
		<li>Kuyu % 90 birleştikten sonra, adipojenik farklılaşma ortamı A ile hücreleri kültüre edin. α-MEM kültür ortamında (%10 FBS ile) kültürlenmiş hücreleri negatif kontrol olarak kullanın.</li>
		<li>2 günlük indüksiyondan sonra, orta A'yı kuyudan epire edin ve her kuyuya 1 mL adipojenik farklılaşma orta B ekleyin.</li>
		<li>Bir gün sonra, orta B'yi çıkarın ve kuyuya geri eklenen orta A ile döngüye tekrar başlayın. A ve B ortamını kullanarak hücreleri dönüşümlü olarak kültüre edin.</li>
		<li>A ve B farklılaşma ortamını üç döngü boyunca dönüşümlü olarak uygulayın ve bu hücrelerin adipogenezini yağ kırmızısı O boyama16,18ile tespit edin. NOT: Bu hücrelerin 2 ila 3 gün daha B farklılaşması ile kültlenerek çok sayıda yuvarlak ve büyük lipit damlacıkları gözlenebilir.</li>
		<li>Ortamı çıkarın ve hücreleri 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Hücreleri PBS ile yıkayın.</li>
		<li>Hücreleri yağ kırmızısı O boyama çözeltisi ile lekeleyin ve yaklaşık 3 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Boyama çözeltisini çıkarın ve kuyuları damıtılmış suyla yıkayın.</li>
		<li>Işık mikroskobu altında adipogenez gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC'lerin kondrogenez indüksiyonu<ol>
<li>5 x105 /cm 2 yoğunlukta 15 mL santrifüj tüpünde P2 mBMSC'ler.</li>
		<li>Tüpleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Üstnatant atın.</li>
		<li>Hücreleri 0,5 mL kondrojenik farklılaşma ortamı ile yeniden biriktirin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin.</li>
		<li>Santrifüj tüpünün kapağını gevşetin ve % 5 CO2 inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya bırakın. Ortamı her 2 günde bir yenileyin. NOT: Hücreler 24 saat sonra peletmeye başlar. Santrifüj tüpünün 48 saat hareket ettirmemeniz önerilir. Ortamı değiştirirken hücre peletini aspire etmemeye dikkat edin.</li>
		<li>21 günlük indüksiyondan sonra, hücre peletlerini% 4 paraformaldehit ile sabitle, ardından dehidrasyon, parafin gömme ve bölümleme.</li>
		<li>Deparaffinizasyon ve hidrasyondan sonra, slaytları Alcian mavi çözeltisinde en az 15 dk18,19,20,21boyunca lekeleyin, ardından reaksiyonu durdurmak için damıtılmış suyla yıkayın. Fotoğrafları ışık mikroskobu altında çek.</li>
		<li>Kollajen tip II'nin immünofluoresan lekeleme için aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Deparaffinizasyon ve hidrasyon adımından sonra slaytları 37 °C'de 15 dakika boyunca 5 μg/mL proteinaz K ile kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Slaytları 37 °C'de 1 saat boyunca engelleme arabelleğine inkübte edin.</li>
			<li>Slaytlara 200 μL blokaj tamponunda 1 μL kollajen tip II antikor uygulayın ve 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Ertesi gün, slaytları PBS ile iki kez yıkayın ve 1 saat boyunca 37 °C'de ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>Dilimleri 10 dakika boyunca 40,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) ile kuluçkaya yatırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Floresan mikroskopisi altında her slaytın fotoğrafını çek.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Gerçek zamanlı PCR
<ol><li>Guanidium izotiyosiyanat bazlı ticari olarak mevcut reaktif kullanarak mBMSC'lerden toplam RNA çıkarın.</li>
	<li>Piyasada bulunan bir kit kullanarak RNA'nın tamamlayıcı DNA'ya ters transkripsiyonunu gerçekleştirin. Ters transkripsiyonun reaksiyon koşulları şu şekildeydi: 5 dakika için 65 °C, 15 dk için 37 °C, 15 sn için 85 °C.</li>
	<li>Tablo 3'te listelenen astarları kullanarak osteogenez ve adipogenez spesifik genleri tespit etmek için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. PCR amplifikasyon prosedürü aşağıdaki gibidir: 5 dakika için 95 °C, 5 s için 95 °C, 40 döngü için 30 sn için 60 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+education+for+medical+students+at+Tongji+University:+Primary+cell+culture+and+directional+differentiation+of+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).</li><li>Chu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Update+on+the+Progress+of+Isolation,+Culture,+Storage,+and+Clinical+Application+of+Human+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem/Stromal+Cells.">An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).</li><li>Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+mesenchymal+stem+cell+therapy+for+ovariectomized+osteoporotic+rats:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow.">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).</li><li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+mesenchymal+stem+cells+of+different+origin.">Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).</li><li>Lloyd, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+and+differences+between+porcine+mandibular+and+limb+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+use+of+adipose+tissue-derived+and+bone+marrow-derived+stem+cells+for+rapid+bone+regeneration.">Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).</li><li>Stefanik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparate+osteogenic+response+of+mandible+and+iliac+crest+bone+marrow+stromal+cells+to+pamidronate.">Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate.</a> Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).</li><li>Aghaloo, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+potential+of+mandibular+vs.+long-bone+marrow+stromal+cells.">Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells.</a> Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).</li><li>Kaigler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+craniofacial+bone+regeneration:+a+randomized,+controlled+feasibility+trial.">Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial.</a> Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).</li><li>Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+osteogenic+differentiation+potential+of+rat+mandibular+and+femoral+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.</a> Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).</li><li>Matsubara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+bone+marrow+as+a+cell+source+for+regenerative+medicine:+differences+between+alveolar+and+iliac+bone+marrow+stromal+cells.">Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).</li><li>Chan, C. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Human+Skeletal+Stem+Cell.">Identification of the Human Skeletal Stem Cell.</a> Cell. 175 (1), 43-56 (2018).</li><li>Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+stem+cells:+nature,+biology,+and+potential+applications.">Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications.</a> Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icariin+prevents+oestrogen+deficiency-induced+alveolar+bone+loss+through+promoting+osteogenesis+via+STAT3.">Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3.</a> Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).</li><li>Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+response+of+mesenchymal+stem+cells+to+continuous+mechanical+strain+is+dependent+on+ERK1/2-Runx2+signaling.">Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling.</a> Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone.">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).</li><li>Lach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+under+Controllable+Serum-Free+Conditions.">Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).</li><li>Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+the+WNT-Signaling+Modulators+BIO+and+PKF118-310+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).</li><li>Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Chondrogenic+Differentiation+Potential+of+Equine+Synovial+Membrane-Derived+and+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).</li><li>Li, X., Zhang, Y., Qi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+isolation+methods+and+culture+conditions+for+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).</li><li>Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+(bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells)+for+bone+tissue+engineering:+basic+science+to+clinical+translation.">Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal(mesenchymal)+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture.">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).</li></ol>

Tüm yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını belirtir.

Bu protokol, güçlü farklılaşma yeteneğine sahip proliferatif mBMSC'ler elde etmenin basit ve güvenilir bir yolu olan tüm kemik iliği yapışması ve floresan hücre sıralamasını birleştirerek BMSC'leri fare mandibulalarından in vitro olarak izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, akış hücresi sıralama ile mBMSC'leri önceden saflaştırabilir, ancak hücre homojenliği için daha yüksek gereksinimler varsa, daha kesin saflaştırma yöntemleri gerekebilir.
<p class="jove_conte...

Kemik iliği mezenkimal kök hücreler (BMSC' ler), kemik iliğinden elde edilen ve güçlü çoğalma yeteneği ve çok soylu farklılaşma potansiyeli gösteren hematopoetik olmayan kök hücrelerdir1,2,3,4. Nitekim BMSC'ler keşfedildiklerinden beri kemik doku mühendisliği ve yenilenmesi için ideal bir aday olarak kabul edilmiştir. Yıllardır, iliak tepe veya kaval kemiği ve uyluk kemiği gibi uzun kemikler kraniyofasiyal rejenerasyon için BMSC'lerin en yaygın kaynağı olmuştur. Bununla birlikte, mandibuler BMSC'ler (mBMSC'ler) gibi orofasiyal BMSC'ler, farklı embriyonik köken ve gelişim patörü gibi uzun kemik BMSC'lerinden bazı farklılıklar gösterir. Mandibulalar nöroektoderm mikrop tabakasının nöral kret hücrelerinden kaynaklanır ve intramembranöz kemikleşmeye uğrar, eksenel ve apandisitrik iskeletler ise mezodermdendir ve endochondral kemikleşmeye uğrar. Ayrıca, klinik gözlemler ve deneysel hayvan çalışmaları sürekli olarak orofacial ve iliak kret BMSC'ler 5,6,7,8arasında fonksiyonel farklılıklar olduğunubelirtmiştir. Raporlar, mandibula, maksiller kemik ve alveolar kemik gibi kraniyofasiyal kemikten elde edilen BMSC'lerin eksenel ve apandisiler kemiklerden üstün çoğalma, yaşam süresi ve farklılaşma yeteneği sergilediğini göstermiştir9. Bu nedenle mBMSC'ler, cherubism, çene tümörü, çene kemiği osteoporoz ve periodontal doku defekti10 , 11,12gibi kraniyofasiyal hastalıkların gelecekteki terapötik uygulamaları için tercih edilen kaynaklar olarak kabul edilir. Preklinik deneylerde tedavi potansiyelini anlamak için, mBMSC'lerin in vitro olarak hızla izole edilmesi ve kült haline getirmek için bir yöntem oluşturmak esastır.
Bu çalışmada tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi tasnifi ile saflaştırılmış mBMSC'lerin elde etmesi amaçlanmıştı. Mikro bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) ve histolojik bölümler ile açıkça gözlenen fare mandibulasının anatomik morfolojisi, mandibulanın trabeküler kemiğinin kesici medüller boşluk ile alveolar kemik arasında olduğunu göstermiştir. Trabeküler kemik kemiğinden kemik iliği mandibular ilik hücreleri elde etmek için yıkandı, ancak bu şekilde kültürlenen hücreler saf mBC'ler değildi ve kemik, yağ ve endotel hücrelerinden hücreler gibi belirsiz potenslere ve çeşitli soylara sahip birden fazla hücre türünden oluşması muhtemeldi13,14. Hücre saflaştırmanın bir sonraki adımı özellikle önemliydi. Akış sitometrisi, hücre yüzeyi proteinlerinin bir kombinasyonunu tanıyarak hücreleri filtreler ve mezenkimal kök hücrelerin zenginleştirilmesinde yaygın olarak benimsenmiştir. Hücre homojenliği akış sitometrisinin ana avantajıdır, ancak işlem hücre canlılığını belirlemez ve sınırlı hücre verimi ile sonuçlanabilir. Bu çalışmada, tüm kemik iliği yapışmasından elde edilen P0 mBMSC'ler, yüksek saflık ve güçlü çoğalma kapasitesine sahip mBMSC'ler elde etmek için akış sitometrisine göre sıralanmıştır.
Bu çalışma, tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralama kombinasyonu kullanılarak sıçan mandibular BMSC'lerin izolasyonu, kültürü ve farklılaşması için tekrarlanabilir ve güvenilir bir protokol sürmektedir. İlgili alanlardaki araştırmacıların kullanması için güvenilir ve kullanışlı bir yöntemdir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acutenaculum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipogenic differentiation medium</td>
			<td>Cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-Minimum essential medium</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30265.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -CollagenII Rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies against CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td>biolegend inc</td>
			<td>102215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>AC2-4S8-CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0461-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0900-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>L500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondrogenesis differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet Staining Solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magzol reagent(Trizol reagent)</td>
			<td>Magen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteogenic differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Kit</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td>RR036A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickBlock Blocking Buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR1 Premix</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats

Burada, deneysel gereksinimler için çok sayıda yüksek kaliteli hücreyi hızla elde etmek için mandibuler kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (mBMSC' ler) in vitro izole etmek ve kültleştirmek için etkili bir yöntem sunuyoruz. mBMSC'ler, mükemmel kendini yenileme yeteneği ve çok soylu farklılaşma potansiyeli nedeniyle gelecekte kraniyofasiyal hastalıklar ve kraniyo-maksillofasiyal rejenerasyon durumunda doku mühendisliği hücreleri olarak terapötik uygulamalarda yaygın olarak kullanılabilir. Bu nedenle, mBMSC'leri çok sayıda elde etmek önemlidir.
Bu çalışmada kemik iliği mandibuladan yıkanmış ve primer mBMSC'ler tüm kemik iliği yapışmış ekimi ile izole edilmiştir. Ayrıca, CD29+CD90+CD45− mBMSC'ler floresan hücre sıralama yoluyla saflaştırılmıştır. İkinci nesil saflaştırılmış mBC'ler daha fazla çalışma için kullanıldı ve osteoblastlara, adipositlere ve kondrositlere farklılaşma potansiyeli gösterdi. Bu in vitro modeli kullanarak, biyolojik özelliklerin incelenmesini, mikroçevrime sonraki reaksiyonları ve mBMSC'lerin diğer uygulamalarını kolaylaştırabilecek yüksek sayıda proliferatif mBMSC elde edilebilir.

Bu protokolü kullanarak, hücrelerin büyük bir kısmı ilk kültürden sonraki üçüncü günde plakaya yapıştı. Tipik olarak, ek bir 3-4 günlük kültürden sonra, hücre birleşmesi% 70 ila 80'e ulaştı (Şekil 1B). Floresan hücre sıralama ile DAPI-CD29 + CD90+CD45− mBMSC'ler P0 hücrelerinde yaklaşık%81,1'ioluşturan 18,22saflaştırılmıştır ( Şekil<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Bu makalede, sıçan mandibulalarından kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek, yetiştirmek, sıralamak ve tanımlamak için tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralamasını birleştiren bir yöntem sunulmaktadır.

Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

isolation-cultivation-mandibular-bone-marrow-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K Görüntüleme.  National Clinical Research center of Stomatology. Bu makalede, sıçan mandibulalarından kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek, yetiştirmek, sıralamak ve tanımlamak için tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralamasını birleştiren bir yöntem sunulmaktadır.

Video: Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Tıp

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Atçılık tendinopatisinde Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli Teknesyum- 99m Vivo Görüntüleme ve Takip

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Bir Osteoartrit Modelinde Minör Dalak, Kemik İliği, Lenf Düğümleri ve Sinovyal DokuDaki İmmün Hücre Alt Kümelerinin Akış Sitometri Analizi

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia (BPD). In premature infants, BPD is a major complication despite early use of surfactant therapy, optimal ventilation strategies, and noninvasive positive pressure ventilation. Because pulmonary inflammation plays a crucial role in the pathogenesis of BPD, corticosteroid use is one potential treatment to prevent it. Nevertheless, systemic corticosteroid treatment is not usually recommended for preterm infants due to long-term adverse effects. Preclinical studies and human phase I clinical trials demonstrated that use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in hyperoxia-induced lung injuries and in preterm infants is safe and feasible. Intratracheal and intravenous MSC transplantation has been shown to protect against neonatal hyperoxic lung injury. Therefore, intratracheal administration of stem cells and combined surfactant and glucocorticoid treatment has emerged as a new strategy to treat newborns with respiratory disorders. The developmental stage of rat lungs at birth is equivalent to that in human lungs at 26&#8722;28 week of gestation. Hence, newborn rats are appropriate for studying intratracheal administration to preterm infants with respiratory distress to evaluate its efficacy. This intratracheal instillation technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into the lungs.

Described is a protocol for performing intratracheal transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs) through intratracheal injection in term neonatal rats. This technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into neonatal rat lungs to evaluate their efficacy.

Dönem Yenidoğan Sıçanlarda Kök Hücrelerin İntratrakeal Aşılanması

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...