Wir danken für die Unterstützung von Laboratory for Digitized Stomatology and Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People es Hospital. Die Arbeit dieses Manuskripts wird durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949] unterstützt, Shanghai Summit & Plateau Disciplines, der SHIPM-mu Fonds des Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], das Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Und L.J. ist Ein Gelehrter des Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program und des Projekts "Chen Xing" der Shanghai Jiaotong University.

Alle tierischen Versuchsverfahren in diesem Papier wurden vom Animal Care Committee des Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, genehmigt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie zwei 5 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten für das Experiment.</li>
	<li>Sterilisieren Sie alle Instrumente, einschließlich Nadelhalter, Pinzette und Schere bei hoher Temperatur oder eingetaucht in 75% Ethanol für 10 min. HINWEIS: Ethanol-Eintauchen sollte nicht zu lang sein, um Zellschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Vorbereiten von Kulturmedien im Voraus, deren Zusammensetzung in Tabelle 1aufgeführt ist. Ergänzen Sie jedes Medium wie unten beschrieben.<ol>
<li>Zubereitung von α-MEM-Kulturmedium (mit 10% FBS): Ergänzung des minimalen essentiellen Mediums Alpha (α-MEM) mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin und Streptomycin.</li>
		<li>Zubereitung des osteogenen Differenzierungsmediums: Ergänzung osteogene Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 0,20% Ascorbinsäure, 1% β-Glycerophosphat und 0,01% Dexamethason.</li>
		<li>Zubereitung eines osteogenen Induktionsmediums: Mischen Sie 70% α-MEM-Kulturmedium (mit 10% FBS) und 30% osteogene Differenzierungsmedium.</li>
		<li>Zubereitung des adipogenen Differenzierungsmediums A: Ergänzung adipogenic Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 0,20% Insulin, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazon und 0,01% Dexamethason.</li>
		<li>Herstellung des adipogenen Differenzierungsmediums B: Ergänzung adipogenic Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 0,20% Insulin.</li>
		<li>Zubereitung des chondrogenen Differenzierungsmediums: Ergänzung chondrogener Differenzierung Basalmedium mit 0,01% Dexamethason, 0,30% Ascorbinsäure, 1% ITS, 0,10% Natriumpyruvat, 0,10% Proline und 1% TGF-3. HINWEIS: Das osteogene Differenzierungsmedium muss innerhalb eines Monats nach der Konfiguration aufgebraucht sein. Die effektive Periode des konfigurierten chondrogenen Differenzierungsmediums beträgt 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung und Kultivierung von Ratten-MBMSCs
HINWEIS: Alle experimentellen Operationen sollten so weit wie möglich auf Eis durchgeführt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.
<ol><li>Ernte von Rattenunterkiefern<ol>
<li>Euthanisieren Sie zwei 5 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten durch CO2 Erstickung. Stellen Sie sicher, dass die Atmung des Tieres gestoppt wird, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.</li>
		<li>Spülen Sie diese Ratten in einem Becher, der 75% Ethanol für 3 min enthält.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte in eine saubere Dunstabzugshaube, um Unterkiefer zu ernten. HINWEIS: Sterilisieren Sie die Dunstabzugshaube vor Gebrauch 30 min lang durch ultraviolette Lichtstrahlung.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte in eine Supine-Position. Schneiden Sie die Häute und Buccinator-Muskeln von bilateralen Angulus oris in die hintere Region des Unterkiefers, die der einzige bewegliche Knochen mit niedrigerem Schneidemittel ist. HINWEIS: Es wird empfohlen, einen 2 cm Schnitt auf jeder Seite des Angulus-Oris zu machen, um ein klares Operationsfeld zu erhalten.</li>
		<li>Öffnen Sie den Mund der Ratte, indem Sie die Kiefer- und Unterkieferschneideschneide schneideinn in die entgegengesetzte Richtung mit beiden Daumen drücken, um die Unterkieferzähne freizulegen, die an der Unterkiefer befestigt sind.</li>
		<li>Trennen Sie die bukkalen Muskeln und Sehnen, die an den Koracoiden befestigt sind, und die untere Grenze des Unterkiefers vollständig ab. HINWEIS: Eine erhöhte Beweglichkeit des Unterkiefers wird während dieses Schritts aufgrund des Mangels an Muskelspannung beobachtet.</li>
		<li>Drücken Sie die unterkieferförmigen hinteren Zähne und drehen Sie sich nach hinten und unten, bis die Kondylen auf beiden Seiten deutlich frei gelegt sind. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um den Mund der Ratte so weit wie möglich künstlich zu öffnen, um den Condyle zu verrenzieren. Der Unterkiefer ist durch bilaterale Kondylen mit dem Schädel verbunden, so dass die Exposition der Kondylen zur Trennung zwischen Schädel und Unterkiefer führt.</li>
		<li>Trennen Sie den Unterkieferkörper vom Schädel.</li>
		<li>Reinigen Sie das anhaftende Weichgewebe auf der Knochenoberfläche mit einer nassen Gaze.</li>
		<li>Legen Sie den Knochen in eine 10 cm sterile Glasschale, gefüllt mit vorgekühlten minimal α en (α-MEM) oder Phosphatpuffer-Saline (PBS) auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung und Kultivierung der mBMSCs<ol>
<li>Schneiden Sie den vorderen Knochen entlang der mesialen Kante des ersten Molaren vom Unterkieferkörper ab. Entfernen Sie den Unterkiefer-Ramus einschließlich Corakoid und Condyle entlang der distalen Kante des dritten Molaren, um die Markhöhle freizulegen.</li>
		<li>Füllen Sie eine 10 cm sterile Glasschale mit 10 ml α-MEM (mit 10% FBS).</li>
		<li>Verwenden Sie 1 ml Spritze, um α-MEM-Kulturmedium zu aspirieren. Mit der Spritzennadel, die in die Knochenmarkhöhle eingeführt wird, spülen Sie das Knochenmark wiederholt in die Schale. Spülen Sie die Knochenhöhle mindestens 3 Mal von beiden mesialen und distalen Seiten des Knochens, bis der Knochen weiß wurde. HINWEIS: Dies ist der kritischste Schritt, da die Knochenmarkhöhle einer Rattenunterkiefer nicht so offensichtlich ist wie bei langen Knochen und der richtige Punkt, um die Nadel einzusetzen, empirisch bestimmt werden muss. Alle oben genannten Versuchsproben sollten auf Eis gelagert werden, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten, so dass die Betriebszeit nicht länger als 2 h betragen darf.</li>
		<li>Übertragen Sie das Medium, das die gespülten Zellen enthält, in ein 15 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 800 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen mit 3 ml α-MEM (mit 10% FBS) wieder aus. Die Zellen in einer neuen 10 cm Kulturschale aufsieben und bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator brüten.</li>
		<li>Überprüfen Sie die morphologischen Veränderungen und das Wachstum dieser Zellen am 3. Tag der Kultur. Entfernen Sie das Kulturmedium mit nicht haftenden Zellen und Gewebefragmenten. Fügen Sie vorsichtig 10 ml frische α-MEM (mit 10% FBS) hinzu.</li>
		<li>Nach 7 Tagen Kultur erreichten P0-MBMSCs 70% bis 80% Zusammenfluss.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchflusszellensortierung HINWEIS: P0-MBMSCs wurden phänotypisch identifiziert und in erster Linie durch Durchflusszellensortierung gereinigt.<ol>
<li>Das Kulturmedium ansaugen und entsorgen und dann das Gericht mit PBS waschen. Entsorgen Sie die PBS.</li>
		<li>1 ml 0,25% Trypsin mit 0,02% EDTA in die Schale geben. Verdauen Sie die Zellen bei 37 °C für 5 min, dann fügen Sie 2 ml α-MEM (mit 10% FBS) hinzu, um die Reaktion zu stoppen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen nach der Zentrifugation in 120 l PBS (mit 10% FBS) aus.</li>
		<li>Blockieren Sie diese Zellsuspensionen mit 1 l Antikörper gegen CD16/CD32 bei 4 °C für 15 min.</li>
		<li>100 l der Zellsuspension in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen, die Zellen mit Phycoerythrin (PE)-konjugiertem Antikörper gegen CD45, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierte Antikörper gegen CD90 und Allophycocyanin (APC)-Antikörper gegen CD29 bei 4 °C bei 1 h im Dunkelnfärben. Die Konzentration der in diesem Experiment verwendeten Antikörper ist in Tabelle 2dargestellt. Verwenden Sie die anderen 20 L zellsuspension als ungefärbte Negativkontrolle.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie dann die Rohre bei 800 x g für 5 min, entsorgen Sie die Suspension und setzen Sie die Zellen in 0,5 ml PBS (mit 10% FBS) wieder auf.</li>
		<li>Fügen Sie vor der Analyse 10 l von 0,01 mg/ml DAPI für 10 min hinzu.</li>
		<li>Verwenden Sie 40 nm Filter, die auf Zentrifugenrohren platziert werden, um die Zellen zu filtern.</li>
		<li>Analysieren Sie die Zellen auf Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer. Stellen Sie die Bedienfelder wie folgt ein. Entfernen Sie zunächst abgestorbene Zellen aus der Gesamtzellenzahl, indem Sie DAPI- Zellen, dann Gate CD29+CD90+CD45- in den ausgewählten Zellen als Ziel-MBMSCs veranlassen.</li>
		<li>Sammeln Sie die sortierten CD29+CD90+CD45- Zellen in ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 3 ml α-MEM (mit 10% FBS) vorgefertigt.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 800 x g für 5 min. Entfernen Sie den Sammlungspuffer, und fügen Sie 1 ml frisches α-MEM (mit 10 % FBS) hinzu, um die Zellen erneut auszusetzen. Dann teller sie in einem 6 cm Kulturgericht.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fähigkeit zur Koloniebildung
HINWEIS: Dieser Schritt wurde ausgeführt, um die Divisionsfähigkeit von mBMSCs zu überprüfen. 15
<ol><li>Wählen Sie die zweite Passage mBMSCs (P2) für dieses Experiment. Wenn der Zellzusammenfluss 80% bis 90% erreichte, sät die Zellen in einem seriellen Gradienten in einer 6-Well-Platte neu, um ihre klonale Proliferationsfähigkeit zu bewerten. HINWEIS: Es wird empfohlen, den Gradienten von 1 x 102 bis 1 x 103 Zellen pro Bohrkörper einzustellen, aber die endgültigen Verdünnungen verschiedener Zelllinien menschlichen oder tierischen Ursprungs wurden empirisch bestimmt.</li>
	<li>Kultur die Zellen in α-MEM (mit 10% FBS) für etwa zwei Wochen, bis eine gute Anzahl der koloniebildenden Einheiten unter Lichtmikroskop gesehen werden konnte. Erfrischen Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.</li>
	<li>Aspirieren und entsorgen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Brunnen mit PBS zweimal für 5 min am Mal. Als nächstes 4% Paraformaldehyd-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und für mindestens 10 min fixieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Paraformaldehyd und spülen Sie die Brunnen zweimal mit PBS.</li>
	<li>Die Zellen mit kristallvioletter Färbelösung färben und in 37 °C ca. 10 min inkubieren. HINWEIS: Die Färbezeit wird entsprechend eingestellt, bis der gewünschte Farbton erreicht ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Proben mit destilliertem Wasser, um die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Bild unter einem Stereomikroskop und zählen verstreute Zellkolonien, die aus mindestens 50 Zellen bestanden.</li>
</ol>4. Multilineage-Differenzierung von mBMSCs
HINWEIS: Die P2-MBMSCs wurden für nachfolgende Experimente verwendet, sofern nicht anders beschrieben.
<ol><li>Osteogene Induktion von mBMSCs<ol>
<li>Digest die mBMSCs wie oben beschrieben. Samenzellen mit einer Dichte von 2,5 x 105/cm2 in einer 12-Well-Platte, ergänzt durch 1 ml α-MEM (mit 10% FBS).</li>
		<li>Wenn der Zellzusammenfluss 60-70% erreichte, ändern Sie das Medium in 30% osteogene Induktionsmedien. Kultur die Zellen mit α-MEM (mit 10% FBS) als negative Kontrolle und ändern Sie das Medium alle 2 Tage. HINWEIS: Nachdem während der Osteogenese eine große Anzahl von Kalziumknötchen auftreten, wird empfohlen, das mittlere Austauschmuster alle 2 Tage auf einen mittleren Volumenaustausch umzutauschen, um zu verhindern, dass Osteoblasten schwimmen.</li>
		<li>Nach der Kultivierung für sieben Tage, bewerten Sie die Verkalkung dieser Zellen durch alkalische Phosphatase Färbung16,17.</li>
		<li>Entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS pro Brunnen für 3 min zweimal.</li>
		<li>Dann färben Sie die Zellen mit alkalischer Phosphatase-Färbungslösung und inkubieren bei 37 °C für 10-30 min. HINWEIS: Die Inkubation kann über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um die gewünschte Farbe zu erhalten.</li>
		<li>Waschen Sie die Brunnen mit destilliertem Wasser, um die Reaktion zu stoppen. Fotografieren Sie unter Lichtmikroskop. Rot pigmentierte sulfierte Granulate stellen die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) dar.</li>
		<li>Nach der Kultivierung der verbleibenden Zellen für weitere 7 Tage, führen Sie Alizarin rote Färbung, um die Mineralisierungskapazität der Zellen zu bewerten.</li>
		<li>Färben Sie die Zellen mit 0,5% Alizarin rote Färbung Lösung nach Zellfixierung für 10 min16,18. Beenden Sie die chromogene Reaktion mit destilliertem Wasser nach 3-5 min. HINWEIS: Die Reaktionszeit kann je nach entwickelter Farbe verlängert werden.</li>
		<li>Schließlich legen Sie die Kulturplatte unter das Lichtmikroskop, um die Wirkung der osteogenen Färbung zu beobachten; rote Knötchen weisen auf Kalziumablagerungen dieser Zellen hin.</li>
	</ol></li>
	<li>Adipogene Induktion von mBMSCs<ol>
<li>Seed P2 mBMSCs in einer 12 WellPlatte, wie oben beschrieben.</li>
		<li>Nach dem Brunnen zu 90% konfluent werden, Kultur die Zellen mit adipogene Differenzierung Medium A. Verwenden Sie Zellen kultiviert in α-MEM Kulturmedium (mit 10% FBS) als negative Kontrolle.</li>
		<li>Nach 2 Tagen Induktion das Medium A aus dem Brunnen ansaugen und in jedem Brunnen 1 ml adipogene Differenzierungsmedium B hinzufügen.</li>
		<li>Nach einem Tag entfernen Sie Medium B und starten Sie den Zyklus wieder mit Medium A wieder in den Brunnen hinzugefügt. Kultur der Zellen abwechselnd mit Medium A und B.</li>
		<li>Tragen Sie das Differenzierungsmedium A und B abwechselnd für drei Zyklen auf und detektieren Sie die Adipogenese dieser Zellen durch ölrote O-Färbung16,18. HINWEIS: Viele runde und große Lipidtröpfchen können beobachtet werden, indem diese Zellen mit Differenzierungsmedium B für weitere 2 bis 3 Tage kultiviert werden.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Waschen Sie die Zellen mit PBS aus.</li>
		<li>Die Zellen mit ölroter O-Färbungslösung beflecken und ca. 3 min bei 37 °C brüten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Brunnen mit destilliertem Wasser.</li>
		<li>Beobachten Sie die Adipogenese unter Lichtmikroskop.</li>
	</ol></li>
	<li>Chondrogenese-Induktion von mBMSCs<ol>
<li>Seed P2 mBMSCs in 15 ml Zentrifugenrohr mit einer Dichte von 5 x 105/cm2.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspend ieren die Zellen mit 0,5 ml chondrogene Differenzierung Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.</li>
		<li>Lösen Sie die Kappe des Zentrifugenrohrs und inkubieren Sie es bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Erneuern Sie das Medium alle 2 Tage. HINWEIS: Zellen beginnen nach 24 h mit dem Pelletieren. Es wird empfohlen, das Zentrifugenrohr nicht für 48 h zu bewegen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu aspirieren, wenn Sie das Medium wechseln.</li>
		<li>Fixieren Sie die Zellpellets nach 21 Tagen Induktion mit 4% Paraformaldehyd, gefolgt von Dehydrierung, Paraffineinbettung und Schnitt.</li>
		<li>Nach Derparaffinierung und Hydratation die Dias in alcian blauer Lösung für mindestens 15 min18,19,20,21färben und dann mit destilliertem Wasser waschen, um die Reaktion zu stoppen. Erfassen Sie die Fotos unter Lichtmikroskop.</li>
		<li>Führen Sie für die immunfluoreszierende Färbung von Kollagen Typ II die folgenden Schritte aus.<ol>
<li>Die Dias nach dem Deparaffinierungs- und Hydratationsschritt mit 5 g/ml Proteinase K für 15 min bei 37 °C inkubieren.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Dias im Sperrpuffer für 1 h bei 37 °C.</li>
			<li>1 L KollagenTyp II Antikörper in 200 l Sperrpuffer auf die Dias auftragen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
			<li>Am nächsten Tag die Dias zweimal mit PBS waschen und bei 37 °C für 1 h mit Sekundärantikörpern bebrüten.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Scheiben mit 40,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 10 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fotografieren Sie jedes Diaunter unter Fluoreszenzmikroskopie.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Echtzeit-PCR
<ol><li>Extrahieren Sie die gesamte RNA aus mBMSCs mit einem Guanidium isothiocyanat, das auf kommerziell erhältlichem Reagenz basiert.</li>
	<li>Führen Sie die umgekehrte Transkription von RNA in komplementäre DNA mit einem handelsüblichen Kit durch. Die Reaktionsbedingungen der Umgekehrten Transkription waren wie folgt: 65 °C für 5 min, 37 °C für 15 min, 85 °C für 15 s.</li>
	<li>Führen Sie Echtzeit-PCR durch, um Osteogenese und Adipogenese-spezifische Gene mithilfe von Primern zu erkennen, die in Tabelle 3 aufgeführt sind. Das PCR-Verstärkungsverfahren war wie folgt: 95 °C für 5 min. 95 °C für 5 s, 60 °C für 30 s für 40 Zyklen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+education+for+medical+students+at+Tongji+University:+Primary+cell+culture+and+directional+differentiation+of+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).</li><li>Chu, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+under+Controllable+Serum-Free+Conditions.">Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).</li><li>Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+the+WNT-Signaling+Modulators+BIO+and+PKF118-310+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).</li><li>Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Chondrogenic+Differentiation+Potential+of+Equine+Synovial+Membrane-Derived+and+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).</li><li>Li, X., Zhang, Y., Qi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+isolation+methods+and+culture+conditions+for+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).</li><li>Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+(bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells)+for+bone+tissue+engineering:+basic+science+to+clinical+translation.">Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal(mesenchymal)+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture.">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).</li></ol>

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um BMSCs von Rattenunterkiefern in vitro zu isolieren, indem ganze Knochenmarkhaftung und fluoreszierende Zellsortierung kombiniert werden, was eine einfache und zuverlässige Möglichkeit ist, proliferative mBMSCs mit starker Differenzierungsfähigkeit zu erhalten. Diese Methode könnte mBMSCs vorläufig durch Durchflusszellensortierung reinigen, aber wenn höhere Anforderungen an die Zellhomogenität bestehen, können präzisere Reinigungsmethoden erforderlich sein.
<p clas...

Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind nicht-hämatopoetische Stammzellen aus Knochenmark abgeleitet, die starke Proliferationsfähigkeit und Multi-Lineage Differenzierungspotenzialmanifestieren 1,2,3,4. Tatsächlich gelten BMSCs seit ihrer Entdeckung als idealer Kandidat für Knochengewebetechnik und -regeneration. Seit Jahren sind der Iliaskamm oder lange Knochen wie Tibia und Oberschenkelknochen die häufigste Quelle von BMSCs für die craniofacial Regeneration. Orofaziale BMSCs, wie z. B. Unterkiefer-BMSCs (mBMSCs), weisen jedoch einige Unterschiede zu langknochenförmigen BMSCs auf, z. B. unterschiedlicheembryonale Herkunft und Entwicklungsmuster. Unterkiefer entstehen aus neuralen Kammzellen der Neuroektoderm-Keimschicht und durchlaufen eine intramembranöse Verknöcherung, während axiale und anhängliche Skelette aus dem Mesoderm stammen und endochondraler Verknöcherung unterzogen werden. Darüber hinaus haben klinische Beobachtungen und experimentelle Tierstudien immer wieder gezeigt, dass es funktionelle Unterschiede zwischen orofazialen und iliac enkchenen BMSCs5,6,7,8gibt. Berichte haben gezeigt, dass BMSCs, die aus craniofacial Knochen wie Unterkiefer, Kieferknochen und Alveolarknochen abgeleitet wurden, eine überlegene Proliferations-, Lebensdauer- und Differenzierungsfähigkeit aufwiesen als solche von axialen und anhänglichen Knochen9. mBMSCs gelten daher als bevorzugte Ressourcen für zukünftige therapeutische Anwendungen von craniofacial Erkrankungen wie Kerubism, Kiefertumor, Osteoporose des Kieferknochens und Parodontalgewebedefekt10,11,12. Um das Behandlungspotenzial in präklinischen Experimenten zu verstehen, ist es wichtig, eine Methode zur schnellen Isolierung und Kultivierung von mBMSCs in vitro zu etablieren.
In dieser Studie bestand das Ziel darin, gereinigte mBMSCs durch vollständige Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierung zu erhalten. Die anatomische Morphologie der Rattenunterkiefer, die durch Mikro-Computertomographie (Micro-CT) und histologische Abschnitte deutlich beobachtet wurde, zeigte, dass der trabekuläre Knochen des Unterkiefers zwischen dem Schneidemittel- und dem Alveolarknochen lag. Das Knochenmark aus trabekulären Knochen wurde gespült, um Unterkiefermarkzellen zu erhalten, aber die auf diese Weise kultivierten Zellen waren keine reinen mBMSCs und waren wahrscheinlich aus mehreren Arten von Zellen mit unsicheren Potenzen und verschiedenen Linien wie Zellen aus Knochen, Fett und Endothelzellen13,14bestehen. Der nächste Schritt der Zellreinigung war besonders wichtig. Durchflusszytometrie filtert Zellen durch Erkennung einer Kombination von Zell-Oberflächen-Proteinen und wurde weithin in der Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen angenommen. Die Zellhomogenität ist der Hauptvorteil der Durchflusszytometrie, aber der Prozess bestimmt nicht die Zelllebensfähigkeit und kann zu einer begrenzten Zellausbeute führen. In dieser Studie wurden die P0-MBMSCs, die aus der gesamten Knochenmarkhaftung gewonnen wurden, nach Durchflusszytometrie sortiert, um mBMSCs mit hoher Reinheit und starker Proliferationsfähigkeit zu erhalten.
Diese Studie führt ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für Isolierung, Kultur und Differenzierung von munterdibulären BMSCs von Ratten ein, das eine Kombination aus ganzer Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierte verwendet. Es ist eine zuverlässige und bequeme Methode für Forscher in verwandten Bereichen zu verwenden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acutenaculum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipogenic differentiation medium</td>
			<td>Cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-Minimum essential medium</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30265.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -CollagenII Rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies against CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td>biolegend inc</td>
			<td>102215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>AC2-4S8-CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0461-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0900-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>L500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondrogenesis differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet Staining Solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magzol reagent(Trizol reagent)</td>
			<td>Magen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteogenic differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Kit</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td>RR036A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickBlock Blocking Buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR1 Premix</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats

Hier präsentieren wir eine effiziente Methode zur Isolierung und Kultivierung von mandibulären Knochenmarkmesenchymalstammzellen (mBMSCs) in vitro, um schnell zahlreiche hochwertige Zellen für experimentelle Anforderungen zu erhalten. mBMSCs könnten in Zukunft aufgrund der hervorragenden Selbsterneuerungsfähigkeit und des Differenzierungspotenzials mit mehreren Linien in therapeutischen Anwendungen als gewebetechnische Zellen bei craniofacial-Erkrankungen und der cranio-maxillofacial Regeneration weit verbreitet sein. Daher ist es wichtig, mBMSCs in großer Zahl zu erhalten.
In dieser Studie wurde das Knochenmark aus dem Unterkiefer gespült und primäre mBMSCs wurden durch den Anbau an ganze Knochenmark-Anhänger isoliert. Darüber hinaus wurden CD29+CD90+CD45mBMSCs durch fluoreszierende Zellsortierung gereinigt. Die zweite Generation von gereinigten mBMSCs wurde für weitere Studien verwendet und zeigte Potenzial in der Unterscheidung in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten. Mit diesem In-vitro-Modell kann man eine hohe Anzahl von proliferativen mBMSCs erhalten, was die Untersuchung der biologischen Eigenschaften, der nachfolgenden Reaktion auf die Mikroumgebung und anderer Anwendungen von mBMSCs erleichtern kann.

Mit diesem Protokoll haftete ein großer Teil der Zellen am dritten Tag nach der Anfangskultur an der Platte. In der Regel erreichte der Zellzusammenfluss nach zusätzlichen 3-4 Tagen Kultur 70 bis 80 %(Abbildung 1B). Mit fluoreszierender Zellsortierung wurden DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSCs18,22, die etwa 81,1% in den P0-Zellen ausmachten (Abbildung 1C) gereinigt....

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Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die die vollständige Knochenmarkhaftung und die Durchflusszytometrie-Sortierung für die Isolierung, Kultivierung, Sortierung und Identifizierung von mesenchymalen Knochenmarkstammzellen aus Rattenunterkiefern kombiniert.

Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

isolation-cultivation-mandibular-bone-marrow-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K Aufrufe.  National Clinical Research center of Stomatology. Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die die vollständige Knochenmarkhaftung und die Durchflusszytometrie-Sortierung für die Isolierung, Kultivierung, Sortierung und Identifizierung von mesenchymalen Knochenmarkstammzellen aus Rattenunterkiefern kombiniert.

Serie: Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Forschung

Medizin

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia (BPD). In premature infants, BPD is a major complication despite early use of surfactant therapy, optimal ventilation strategies, and noninvasive positive pressure ventilation. Because pulmonary inflammation plays a crucial role in the pathogenesis of BPD, corticosteroid use is one potential treatment to prevent it. Nevertheless, systemic corticosteroid treatment is not usually recommended for preterm infants due to long-term adverse effects. Preclinical studies and human phase I clinical trials demonstrated that use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in hyperoxia-induced lung injuries and in preterm infants is safe and feasible. Intratracheal and intravenous MSC transplantation has been shown to protect against neonatal hyperoxic lung injury. Therefore, intratracheal administration of stem cells and combined surfactant and glucocorticoid treatment has emerged as a new strategy to treat newborns with respiratory disorders. The developmental stage of rat lungs at birth is equivalent to that in human lungs at 26&#8722;28 week of gestation. Hence, newborn rats are appropriate for studying intratracheal administration to preterm infants with respiratory distress to evaluate its efficacy. This intratracheal instillation technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into the lungs.

Described is a protocol for performing intratracheal transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs) through intratracheal injection in term neonatal rats. This technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into neonatal rat lungs to evaluate their efficacy.

Intratracheale Instillation von Stammzellen bei Term Neonatal Ratten

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...