このプロトコルは、研究者が分子および化学的摂動と定量的行動分析を組み合わせることによって、この行動の根底にあるプラナリアン行動およびsecメカニズムを明らかにすることを可能にする。この技術は、自由な移動プラナリアンの定量的な行動読み出しを得るために高度な機器や特殊なソフトウェアを必要としないため、すべてのスキルレベルに簡単にアクセスできます。スクランチングは、プラナリアンの例外を研究するために使用することができ、ゼノバイオティクスや病気によって引き起こされる神経系機能を破壊し、アッセイに敏感なエンドポイントとして機能します。
まず、均一な白い背景を提供し、適切なコントラストを得るために調整可能な光源として使用できる平らな面に調光可能なLEDパネルを配置します。LEDパネルに100ミリメートルペトリ皿アリーナを配置します。アリーナの上のリングスタンドにカメラを取り付け、アリーナ全体が視野内を中心にして焦点を合わせるように、必要に応じて位置、高さ、フォーカスを調整します。
最大音量を持っている適切な露出メディアの約25ミリリットルでアリーナを埋める、LEDパネルをオンにし、記録品質に悪影響を与える可能性がある他の光源をオフにします。転送ピペットを使用してアリーナの中央にプラナリアンをドロップします。化学溶液を試験する際には、化学薬品の濃度が大きく変化しないように、できるだけ少ないプラナリアン水でプラナリアンを移送します。
ネイティブフィジー形式で画像シーケンスとしてデータの記録を開始します。滑空実験の場合、滑空動作の1〜2分を記録し、スクランチングまたは蠕動性実験のために、直線で起こる少なくとも3つの連続した振動を捕捉するのに十分な長さを記録する。実験が完了したら、記録を終了します。
プラナリアンが終了基準を満たさずにアリーナの境界に達した場合は、プラナリアンをアリーナの中心に戻します。フィジーで実験の生の画像シーケンスを開き、8 ビットに変換し、イメージ スタックの下部にある矢印ツールまたはスライダーを使用して、イメージ シーケンスをパンします。対象の期間と領域を抽出するには、四角形ツールを使用して、平面の完全なパスを含む対象領域を描画します。
イメージスタックを右クリックして複製を選択し、重複するスタックのチェックボックスをオンにします。対象となるシーケンスの最初と最後のフレームを入力し、[はい] をクリックします。滑空実験の場合は、平坦な動きが少なくとも2倍の体長をスクランチまたは蠕動実験のために滑空する期間を抽出します。
プラナリアンが最低3回連続し、完全なボディ振動を直線で行った場合に、インスタンスを抽出します。複製されたイメージ スタックにしきい値を適用して画像を二元化し、背景からプラナリアンを抽出し、平坦全体が赤で強調表示されるようにスライド バーを調整します。正確な値は、イメージング品質に依存します。
暗い背景のボックスを残し、ヒストグラムをスタックし、範囲をリセットしないイメージ スタックをスクロールして、適切なしきい値範囲を確認し、[適用] をクリックします。「スタックをバイナリに変換」ウィンドウで、メソッドをデフォルトに、背景を明るく設定します。
このウィンドウのすべてのボックスのチェックを外し、[大丈夫]をクリックします。白い背景に黒い平面を示すバイナリ化された画像が表示されます。イメージ シーケンスのすべてのフレームで、プラナリアン全体が表示されていることを確認します。
[分析]をクリックして測定を設定し、測定値を設定します。領域、重心、スタック位置、フィット楕円のチェックボックスをオンにして、[大丈夫]をクリックします。開いたイメージ スタックを選択し、解析を選択してパーティクルを解析します。
[パーティクルの解析]ウィンドウで、[show]と[masks]を選択して、選択したパラメータで検出されたすべてのオブジェクトを表示する新しいスタックを開きます。平坦な領域に入って不要なノイズを除去するサイズフィルタを設定します。次に、結果を表示するチェックボックスをオンにして、結果をクリアし、[大丈夫]をクリックします。
パネルの下部にあるスライダーを使用してマスクイメージスタックをパンし、平面のないノイズやフレームがないことを確認します。結果ウィンドウで、ファイルを使用してデータを保存し、ファイル名に CSV 拡張子を追加して、データをコンマ区切り値で保存します。イメージ スタックのデータを保存したら、それぞれのイメージ スタック結果とマスク ウィンドウを閉じます。
有害な温度でスクランチを誘発するには、ガラスビーカーのプラナリアン水をホットプレートで摂氏65度に加熱します。アリーナの中央にプラナリアンを配置し、それが自分自身を直立して滑空を開始するまで待ってから、録音を開始します。P 200ピペットを使用して、予熱されたプラナリアン水の100マイクロリットルをゆっくりと一貫してピペットにし、プラナリアンの尾端に咽頭を置いてスクランチを誘発する。
一度しゃがみ込んでしまったら、録音を停止します。回収容器にプラナリアンを置き、より多くの実験を実行する場合は、新鮮な室温プラナリアン水とペトリ皿のメディアを交換します。切断を介してスクランチを誘発するには、プラナリアンをアリーナの中心に移し、プラナリアンが直立して滑空を開始するまで待ちます。
その後、記録を開始し、きれいなカミソリの刃でプラナリアンを切断します。カット位置が実験全体で一貫していることを確認する。前部の部分がしゃがみなくなったら録音を停止します。
両方の部分を取り除き、別の容器に入れ、7日間再生できるようにします。切断されたプラナリアンは、再生後にホームコンテナに再組み込むことができます。このプロトコルは、UV光暴露の近くにあるかどうかをテストするために使用され、S.mediterraneaとD.japonicaプラナリアンでスクランチを誘発し、D.japonicaプラナリアンは、UV光の近くに曝露されると、S.地中海のプラナリアンは尾の間引きを示すか、応答しないかのどちらかを示す。
少なくとも3つの連続した直線スクランチを示したD.japonicaプラナリアンのためのスクランチングパラメータの定量化は、マウスの250ミクロモルシンナムアルデヒド未知のTRPA1アゴニストへの対照的暴露において、この種の特性をスクランチングパラメータを明らかにし、スクランチングおよびS.地中海を引き起こす。一方、D.japonicaのプラナリアンは、滑空や激しい頭の回転によって中断されたヘビのような動きと振動運動の混合物を表示します。少なくとも3つの連続振動を有するサンプルの定量化は、4つのパラメータのうち3つのパラメータについて有意に低い値をもたらし、その後D.japonicaでスクランチが予想され、観察された振動運動が収縮していないことを示す。
RNAiは、S.地中海におけるシナアルデヒド暴露に対するスクランチングおよび応答の特異性を確認する。プラナリアン水の暴露から180秒以内に、すべての制御RNAiプラナリアンがスクランチ。SMTRPAの1 RNAiプラリアンのどれもに比べて、S.地中海がシナアルデヒドでスクランチすることを実証するSMTRPA 1つがSMTRPA 1を必要とすることを示しています。
騒音を低減し、行動測定で再現性を確保するために、動物の操作方法を一貫性を保つ必要があります。このプロジェクトは、ここではキャプチャされていない他の平面的な動作を識別し、定量化することを可能にするボディ形状解析を含むように拡張することができます。
