Este protocolo permite a los investigadores aclarar el comportamiento plano y los mecanismos de segundo subyacentes a este comportamiento mediante la combinación de análisis cuantitativos del comportamiento con perturbaciones moleculares y químicas. Esta técnica es fácilmente accesible a todos los niveles de habilidad, ya que no requiere instrumentos avanzados o software especializado para obtener lecturas cuantitativas del comportamiento de los planarios móviles libres. Scrunching se puede utilizar para estudiar la excepción en planarios, y sirve como punto final sensible para el ensayo, alterando la función del sistema nervioso causada por xenobióticos y enfermedades.
Comience colocando un panel LED regulable sobre una superficie plana, que proporcionará un fondo blanco uniforme y se puede utilizar como una fuente de luz ajustable para obtener el contraste adecuado. Coloque una arena de 100 milímetros en el panel LED. Montar una cámara en un soporte de anillo por encima de la arena y ajustar su posición, altura y enfoque según sea necesario para que toda la arena esté centrada dentro del campo de visión y esté en foco.
Llene la arena con aproximadamente 25 mililitros de los medios de exposición apropiados para tener el volumen máximo, encienda el panel LED y apague cualquier otra fuente de luz que pueda afectar negativamente a la calidad de grabación. Suelta un plano en el centro de la arena usando una Pipeta de transferencia. Al probar una solución química, transfiera el plano con la menor cantidad posible de agua planaria, de modo que la concentración del producto químico no cambie significativamente.
Comience a grabar datos como secuencias de imágenes en un formato nativo de Fiji. Para los experimentos de deslizamiento, registre de uno a dos minutos de comportamiento de deslizamiento, para experimentos de scrunching o peristalsis, registre el tiempo suficiente para capturar al menos tres oscilaciones consecutivas que ocurren en línea recta. Una vez completado el experimento, termine la grabación.
Si el planario alcanza el límite de la arena sin cumplir con el criterio de terminación, pipetee el planarian de vuelta al centro de la arena. Abra la secuencia de imágenes sin procesar para un experimento en Fiji, conviértala a ocho bits y utilice la herramienta de flecha o el control deslizante en la parte inferior de la pila de imágenes para desplazarse por la secuencia de imágenes. Para extraer un período de tiempo y una región de interés, dibuje una región de interés que abarque la ruta completa de un planario utilizando la herramienta rectángulo.
Haga clic con el botón derecho en la pila de imágenes y seleccione duplicado, marque la casilla donde pila duplicada. Introduzca el primer y el último fotograma de la secuencia de interés y haga clic en Aceptar. Para experimentos de deslizamiento, extraiga un período de deslizamiento donde el plano se mueve al menos el doble de su longitud corporal para experimentos de scrunching o peristalsis.
Extraiga una instancia cuando el planario se someta a un mínimo de tres oscilaciones corporales consecutivas y completas en línea recta. Aplique un umbral a la pila de imágenes duplicadas para binarizar la imagen y extraer el planoario del fondo, ajuste las barras deslizantes para que todo el planario se resalte en rojo. Los valores exactos dependen de la calidad de la imagen.
Deje las casillas para el fondo oscuro, apilar histograma y no restablecer el rango sin marcar. Desplácese por la pila de imágenes para asegurarse de que un buen rango de umbrales y, a continuación, haga clic en Aplicar. En la pila de conversión en ventana binaria, establezca el método en default y el fondo en light.
Desmarque todas las casillas en esta ventana y luego haga clic en OK. Aparecerá una imagen binarizada que muestra un plano negro sobre un fondo blanco. Asegúrese de que todo el plano está visible en todos los fotogramas de la secuencia de imágenes.
Establezca las medidas haciendo clic en analizar y establecer medidas. Marque las casillas de área, centro de masa, posición de pila y ajuste de elipse, luego haga clic en OK. Seleccione la pila de imágenes abiertas y seleccione analizar y analizar partículas.
En la ventana Analizar partículas, seleccione mostrar y máscaras para abrir una nueva pila que muestre todos los objetos detectados con los parámetros elegidos. Establezca un filtro de tamaño para eliminar el ruido no deseado introduciendo el área aproximada del plano. A continuación, marque las casillas para mostrar los resultados y desactive los resultados y haga clic en Aceptar.
Desplazamiento panorámico a través de la pila de imágenes de máscara utilizando el control deslizante en la parte inferior del panel para asegurarse de que no hay ruido o marcos sin un planario. En la ventana de resultados, guarde los datos con file y guárdelos como, agregue la extensión CSV al nombre de archivo para guardar los datos como valores separados por comas. Una vez guardados los datos de la pila de imágenes, cierre los resultados de la pila de imágenes respectivas y las ventanas de máscara.
Para inducir el scrunching a través de una temperatura nocárica, caliente el agua planaria en un vaso de vaso de vidrio a 65 grados celsius en una placa caliente. Coloque un planario en el centro de la arena, y espere hasta que se oriente erguido y comience a deslizarse, luego comience a grabar. Utilice una pipeta P 200 para pipetear lentamente y consistentemente 100 microlitros del agua planaria precalentada, post faríngea en el extremo de la cola del planario para inducir el esquico.
Detenga la grabación, una vez que el scrunching haya cesado. Coloque el planario en un recipiente de recuperación e intercambie los medios en el plato Petri con agua planaria a temperatura ambiente fresca, si realiza más experimentos. Para inducir el scrunching a través de la amputación, transfiera un plano al centro de la arena y espere hasta que el plano se oriente erguido y comience a deslizarse.
A continuación, comience a grabar, amputar el planario con una cuchilla de afeitar limpia. Asegurarse de que la ubicación de corte es coherente en todos los experimentos. Detenga la grabación una vez que la pieza anterior haya dejado de correr.
Retire ambas piezas, colóquelas en un recipiente separado y deje que se regeneren durante siete días. Los planarios amputados se pueden reincorporarse al contenedor doméstico una vez que se han regenerado. Este protocolo se utilizó para probar si la exposición a la luz UV casi, induce el esquico en S.mediterranea y D.japonica planarios, mientras que los planarios D.japonica se escrutan, cuando se exponen a la luz CASI UV, los planarios de S.mediterráneonea presentan adelgazamiento de la cola o ninguna respuesta.
Una cuantificación de los parámetros de scrunching para los planarios D.japonica que exhibieron al menos tres scrunches consecutivos de línea recta, revela características parámetros de scrunching para esta especie En contraste la exposición a 250 micromolares cinnamaldehído desconocido TRPA un agonista en ratones, causa scrunching y S.medineaterra. Mientras que los planarios D.japonica muestran una mezcla de movimiento de serpiente y oscilatorio interrumpido por deslizamiento o giros vigorosos en la cabeza. Una cuantificación de las muestras con al menos tres oscilaciones consecutivas, produjo valores significativamente más bajos para tres de cuatro parámetros que luego se esperaba para la ejecución en D.japonica, lo que indica que el movimiento oscilatorio observado no es esquivar.
El ARNi confirma la especificidad del esquivar y la respuesta a la exposición al cinnamaldehído en S.mediterranea. Dentro de los 180 segundos de exposición en agua planaria, todos controlan el RNAi planarian revuelto. En comparación con ninguno de los SMTRPA, un planario de ARNi que demuestre que S.mediterranea escabando en cinnamaldehído requiere SMTRPA uno.
Es esencial ser consistente y cómo los animales son manipulados para reducir el ruido y asegurar la reproducibilidad en las mediciones conductuales. Estos proyectos se pueden expandir para incluir el análisis de la forma del cuerpo, lo que permitiría la identificación y cuantificación de otros comportamientos planarios que no se capturan aquí.
