Этот протокол позволяет исследователям прояснить планарное поведение и механизмы сек, лежащие в основе этого поведения, сочетая количественный поведенческий анализ с молекулярными и химическими возмущениями. Этот метод легко доступен для всех уровней квалификации, поскольку он не требует передовых инструментов или специализированного программного обеспечения, чтобы получить количественные поведенческие считывания свободных движущихся planarians. Scrunching может быть использован для изучения исключений в planarians, и служит чувствительной конечной точкой для анализа, нарушая функции нервной системы, вызванные ксенобиотики и болезни.
Начните с размещения тусклой светодиодной панели на плоской поверхности, которая обеспечит единый белый фон и может быть использована в качестве регулируемого источника света для получения соответствующего контраста. Поместите 100-миллиметровую арену чашки Петри на светодиодную панель. Установить камеру на кольцо стоять над ареной и регулировать свое положение, высоту и фокус по мере необходимости, так что вся арена сосредоточена в поле зрения и находится в центре внимания.
Заполните арену примерно 25 миллилитров соответствующих средств экспозиции, чтобы иметь максимальный объем, включите светодиодную панель и выключите любые другие источники света, которые могут негативно повлиять на качество записи. Бросьте planarian в центре арены с помощью передачи Pipette. При тестировании химического раствора, передать planarian с как можно меньше планарной воды, как это возможно, так что концентрация химического вещества не существенно изменилась.
Начните записывать данные в качестве последовательностей изображений в родном формате Фиджи. Для экспериментов скольжения, запись от одной до двух минут скольжения поведения, для scrunching или перистализ экспериментов, запись достаточно долго, чтобы захватить по крайней мере три последовательных колебаний, происходящих в прямой линии. Как только эксперимент завершен, прекратите запись.
Если планарианец достигает границы арены, не удовлетворяя критерию расторжения, пипетка планарного обратно в центр арены. Откройте необработанную последовательность изображений для эксперимента на Фиджи, преобразуйте ее в восемь битов и используйте инструмент стрелки или ползунок в нижней части стека изображений, чтобы просмотреть последовательность изображений. Чтобы извлечь период времени и область интереса, нарисуйте область интересов, охватывающая полный путь планария с помощью прямоугольника инструмента.
Право нажмите на стек изображения и выберите дубликат, проверьте поле, где дублирует стек. Введите первый и последний кадры последовательности интереса и нажмите хорошо. Для планерных экспериментов, извлечь период скольжения, где planarian движется по крайней мере в два раза его длина тела для scrunching или перистализ экспериментов.
Извлекайте случай, когда планарианец проходит как минимум три последовательных и полных колебания тела по прямой линии. Примените порог к дублируемому стеку изображений, чтобы бинаризировать изображение и извлечь планар из фона, отрегулируйте раздвижные полосы так, чтобы весь планарианец был выделен красным цветом. Точные значения зависят от качества изображения.
Оставьте ящики на темном фоне, сложите гистограмму и не сбрасывайте диапазон бесконтрольно. Прокрутите стек изображений, чтобы обеспечить хороший пороговый диапазон, а затем нажмите применить. В стеке преобразования в двоичное окно установите метод по умолчанию, а фон для освещения.
Снимите все коробки в этом окне, а затем нажмите хорошо. Появится бинаризованное изображение, показывающее черного планариана на белом фоне. Убедитесь, что весь planarian виден во всех кадрах последовательности изображения.
Установите измерения, нажав на анализ и установите измерения. Проверьте коробки для области, центр массы, положение стека и подходят эллипса, а затем нажмите хорошо. Выберите открытый стек изображений и выберите анализ и анализ частиц.
В окне анализа частиц выберите шоу и маски, чтобы открыть новый стек, показывающий все объекты, которые были обнаружены с выбранными параметрами. Установите фильтр размера для удаления нежелательного шума, введя примерную область плана. Затем проверьте коробки для отображения результатов и четкие результаты и нажмите хорошо.
Пан через стек изображения маски с помощью ползунка в нижней части панели, чтобы убедиться, что нет шума или кадров без planarian. В окне результатов сохраните данные с помощью файла и сохраните его, добавляя расширение CSV в имя файла, чтобы сохранить данные в качестве запятых разделенных значений. После того, как данные для стека изображений сохраняются, закройте соответствующие результаты стека изображений и закройте окна.
Чтобы вызвать scrunching через вредные температуры, тепла planarian воды в стакане до 65 градусов по Цельсию на горячей тарелке. Поместите планарного в центре арены, и ждать, пока он ориентируется в вертикальном положении и начинает скользить, а затем начать запись. Используйте P 200 Pipette медленно и последовательно пипетки 100 микролитров разогретой планарной воды, после pharyngeal на хвосте planarian, чтобы вызвать scrunching.
Остановите запись, как только сморщение прекратится. Поместите планарного в контейнер для восстановления и обмена средствами массовой информации в чашке Петри со свежей комнатной температуры planarian воды, если работает больше экспериментов. Чтобы вызвать scrunching через ампутацию, передать planarian в центре арены и ждать, пока planarian ориентируется в вертикальном положении и начинает скользить.
Затем начните запись, ампутировать planarian с чистым лезвием бритвы. Убедившись, что расположение разреза соответствует экспериментам. Остановите запись, как только передняя часть перестанет scrunching.
Удалите оба куска, поместите их в отдельный контейнер и дайте им регенерировать в течение семи дней. Ампутированный planarians можно reincorporated в домашний контейнер как только они регенерировали. Этот протокол был использован для проверки того, вблизи воздействия УФ-излучения, вызывает scrunching в S.mediterranea и D.japonica planarians, в то время как D.japonica planarians scrunch, при воздействии вблизи УФ-излучения, S.mediterranea planarians либо экспонат хвост истончение или нет ответа.
Количественная оценка параметров scrunching для D.japonica planarians, которые выставлены по крайней мере три последовательных прямых линий scrunches, показывает характеристики scrunching параметров для этого вида В отличие от воздействия 250 микромолярной cinnamaldehyde неизвестных TRPA один агонист у мышей, вызывает scrunching и S.mediterranea. В то время как планарианцы D.japonica отображают смесь змееподохового и осцилляторного движения, прерываемого скользящими или энергичными поворотами головы. Количественная оценка образцов, по крайней мере три последовательных колебаний, дали значительно более низкие значения для трех из четырех параметров, то ожидается для scrunching в D.japonica, что свидетельствует о том, что наблюдаемое осцилляторное движение не сжимается.
RNAi подтверждает специфику scrunching и ответ на воздействие cinnamaldehyde в S.mediterranea. В течение 180 секунд после воздействия в планарной воде, все контроль РНК planarian scrunched. По сравнению с ни одним из SMTRPA один РНК planarians демонстрируя, что S.mediterranea scrunching в cinnamaldehyde требует SMTRPA один.
Важно быть последовательным и как животные манипулируют, чтобы уменьшить шум и обеспечить воспроизводимость в поведенческих измерениях. Эти проекты могут быть расширены, чтобы включить анализ формы тела, который позволил бы для идентификации и количественной оценки других планарных поведения, которые не захвачены здесь.
